Ring fingerモチーフを有する新規遺伝子SRG34の分子生物学的研究

具有无名指基序的新基因SRG34的分子生物学研究

基本信息

批准号：
12770045
负责人：
山田光彦
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Showa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12770045/
关键词：
Ring H2 finger motif zinc finger family ラット脳遺伝子 kf-1 分子生物学抗うつ薬

项目摘要

我々はこれまで、抗うつ薬(イミプラミン、サートラリン)長期投与によりラット脳内で発現の変化する遺伝子およびEST(expressed sequence tags)を網羅的に探索する作業を続け、これまでに約200個の候補遺伝子を同定してきた。その中で、SRG#34フラグメントの部分塩基配列をもとに5'及び3'RACE(rapid amplification of cDNA ends)法により全塩基配列を決定し相同性検索を行ったところ、アルツハイマー病患者死後脳で発現が増加する遺伝子として発見されたkf-1と高相同性を示すことが明らかとなった。また、予測されるアミノ酸配列から、タンパクの折り畳みに関与していると考えられるZinc fingerファミリーであるRing fingerモチーフ(Ring-H2 fingerモチーフ)を有することが明らかとなった。RT-PCR法により発現の変化を再確認・定量したところ、コントロール群と比較し抗うつ薬長期投与群のラット海馬で約3倍、前頭葉皮質で約1.5倍の増加が確認された。しかし、単回投与、及び他の中枢神経系作動薬であるハロペリドールでは発現の増加が認められなかったことより、SRG#34の発現変化は、抗うつ薬の臨床効果に深く関与している可能性が示唆された。さらに、ラット各組織における発現をノザンブロッティング法により比較した結果、肝臓、腎臓に多く、脳、心臓にも発現しているが、脾臓、肺、骨格筋には非常に少ないか、あるいは発現が見られないことが明らかとなった。現在、作製した抗SRG#34抗体を用いて、タンパクレベルでの発現変化及び免疫組織化学的手法により分布等の検討を行っている。今後、本遺伝子がコードするタンパクの生体における生理機能を検討するために本遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを培養細胞に導入し、細胞の基本的機能である分化・増殖、細胞周期、生存について検討する計画である。さらに、遺伝子-タンパク相互作用を検討し、可能であればDNA-タンパク複合体の形成を検討するためのアッセイ系(ゲルシフト法、スーパーシフト法)を構築することを計画している。

我们继续全面寻找因长期服用抗抑郁药（丙咪嗪、舍曲林）而在大鼠大脑中发生表达变化的基因和EST（表达序列标签），迄今为止已鉴定出约200个候选基因。。基于SRG#34片段的部分核苷酸序列，我们使用5'和3'RACE（cDNA末端快速扩增）方法确定了整个核苷酸序列，并进行了同源性搜索，结果表明该基因显示出高度的同源性。 kf-1，被发现是一种在人体内表达增加的基因。此外，预测的氨基酸序列显示其具有环指基序（Ring-H2指基序），它是锌指家族的成员，被认为参与蛋白质折叠。当我们使用RT-PCR重新确认和量化表达变化时，我们发现与对照组相比，长期抗抑郁药物组大鼠的海马体增加了约3倍，额叶皮层增加了1.5倍。然而，由于单次给药或氟哌啶醇（另一种中枢神经系统激动剂）没有观察到表达增加，因此表明 SRG#34 表达的变化可能与抗抑郁药的临床效果密切相关。此外，使用Northern blotting比较大鼠组织中的表达，发现其在肝脏和肾脏中大量表达，并且在脑和心脏中也大量表达，但在脾脏中观察到很少或没有表达，很明显，这是不可能做到的。目前，我们正在使用我们创建的抗SRG#34抗体，利用免疫组织化学技术研究蛋白质水平的表达变化和分布。未来，我们将将该基因的反义寡核苷酸引入培养细胞中，检测该基因编码的蛋白质在活体生物体中的生理功能，考察细胞的分化、增殖、细胞周期、生存等基本功能。我们计划这样做。此外，我们计划构建检测系统（凝胶位移法、超级位移法）来检查基因-蛋白质相互作用，如果可能的话，检查DNA-蛋白质复合物的形成。