時間分割X線構造解析による銅含有アミン酸化酵素のトパキノン生成機構の研究

利用时间分辨X射线结构分析研究含铜胺氧化酶产生托帕醌的机理

基本信息

批准号：
11780479
负责人：
山口宏
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Kwansei Gakuin University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

銅含有アミン酸化酵素中に存在するトパキノン補酵素の生成過程を明らかにするために反応中間体のモデル系や反応中間体の構造決定を液体窒素温度条件下のX線結晶解析法によって試みた。回折強度データの収集は、PFおよびSPring8のシンクロトロン放射光を用いて行った。まず、アポ型酵素に最初にCu^<2+>が結合する時の構造モデルとして、アポ型酵素にCu^<2+>の代わりにZn^<2+>、Co^<2+>、Ni^<2+>を結合させて結晶構造を決定した。その結果、各イオンは、トパキノン前駆体のTyr残基のOHと3つのHis残基で歪んだ四面体配位をとることが明らかになった。次に、Tyr残基と反応する酸素分子の初期的な結合部位を決定するために、Zn^<2+>を結合させたアポ型結晶を用い、Xeガスを10気圧で結晶に導入し、低温条件に移し構造解析を行った。その結果、Xe分子が金属結合部位から約7Å離れた疎水性領域に結合することを見いだし、酸素の初期結合部位であると推定した。次に、グローブボックス中で無酸素条件下でアポ型酵素結晶にCu^<2+>を結合させ、酸素飽和の母液に結晶を移して生成反応を開始させ、低温条件にすることにより反応中間体のトラップを試みた。結晶の顕微分光を行ったところ、幾つかの結晶でアポ型ホロ型とは異なった吸収スペクトルを示した。これらの結晶の回折強度データを収集し、電子密度の解析を行ったところTyr残基近傍に乱れた電子密度が観測され、反応初期の反応中間体の電子密度が現れたものと推定された。以上の結果より、初期的な反応の進行は、以下のように推定された。まずTyr残基が直接銅イオンの配位子となり、銅イオンが四面体構造をとる。次に金属結合部位の近傍に結合していた酸素が、銅イオンの結合後、His592のコンフォメーション変化により空いたスペースに移動し、銅イオン及びTyr残基と相互作用し反応が進行する。

为了阐明含铜胺氧化酶中托帕醌辅酶的形成过程，我们尝试在液氮温度条件下利用X射线晶体学确定反应中间体的模型体系和反应中间体的结构。使用 PF 和 SPring8 的同步加速器辐射收集衍射强度数据。首先，作为Cu^<2+>首先与apo型酶结合时的结构模型，Zn^<2+>、Co^<2+>、Co^<2+>，而不是Cu^<2+ >，通过键合Ni 2+ 确定晶体结构。结果表明，每个离子与托帕醌前体的 Tyr 残基和三个 His 残基的 OH 具有扭曲的四面体配位。接下来，为了确定与Tyr残基反应的氧分子的初始结合位点，我们使用与Zn^<2+>结合的apo型晶体，并在10个大气压下向晶体中通入Xe气体，对结构进行了分析。低温条件。结果发现，Xe 分子结合到距金属结合位点约 7 Å 的疏水区域，该区域被认为是氧的初始结合位点。接下来，在手套箱中的缺氧条件下，Cu ^ 2+ 与apo型酶晶体结合，将晶体转移至氧饱和母液中以开始生产反应，并通过降低反应温度来介导反应。我尝试了身体陷阱。晶体的显微光谱显示，一些晶体具有与阿波全息型不同的吸收光谱。当收集这些晶体的衍射强度数据并进行电子密度分析时，在Tyr残基附近观察到无序电子密度，并且推测电子密度在反应初期出现在反应中间体中。根据以上结果，初始反应进度估计如下。首先，Tyr残基直接成为铜离子的配体，铜离子呈现四面体结构。接下来，铜离子结合后，金属结合位点附近结合的氧移动到His592构象变化所腾出的空间，与铜离子和Tyr残基相互作用，反应进行。