極低温時間分割X線結晶構造解析による銅アミン酸化酵素の自己触媒活性化機構の研究

利用低温时间分辨X射线晶体结构分析研究铜胺氧化酶的自催化激活机制

基本信息

批准号：
09780525
负责人：
山口宏
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kwansei Gakuin University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

Arthrobacter globiformis由来のモノアミン酸化酵素は、生合成時にまず前駆体不活性型として合成され、活性部位に存在するTyr残基が、銅イオンと酸素の存在下で翻訳後修飾を受けトパキノンに変換され活性型に変化する。平成9年度の本酵素の前駆体不活性型(apo型)と活性化型(holo型)の構造決定により、活性化過程における構造変化は活性部位近傍のHis残基とトパキノンに変換されるTyr残基のみにおこることを明らかにした。さらに、それらの構造を踏まえて活性化機構を推定した。平成10年度は、この提唱した活性化機構中で、最初に銅イオンがとると予測した正四面体配位構造を確認するために、トパキノン生成が起こらないことが明らかであるニッケル及びコバルトイオンを銅イオンの代わりにapo型に結合させた結晶を作製し、高エネルギー加速器研究機構のシンクロトロン放射光を用いて回折強度データを収集し、それらの構造を決定した。その結果、配位子となるべき3つのヒスチジン残基とチロシン残基の水酸基は、コバルト及びニッケルイオンの回りに正四面体に近い配置を持っていることが明らかになり、銅イオンがapo型に配位するとき最初に正四面体構造をとることを強く示唆した。この事より、酸素分子の活性化は、銅イオンの四面体配位に近い中間体構造による、酸化還元電位の上昇にあると結論づけた。また、反応中間体を低温トラップし、時間分割解析するための条件検索を行い、30%グリセロール存在下で液体窒素温度での回折強度収集ができることを明らかにした。今後の研究の基礎データとして、110Kにおいて、apo型、holo型のデータ収集を行い構造を精密化した。

在实时合成时，首先将源自源自关节杆菌的球菌的单胺氧化物氧化物作为前体合成，并且在活性位点中存在的Tyr残基在转化为topakinon后将其转化为topakinon它变为模具。由于前体非活性类型（APO类型）的结构测定，在激活过程中将Tyr转换为他的残留物和Topakinon，并在1997年的该酶的激活类型（Holo类型）转换为残留物。此外，基于这些结构估算了激活机制。在1998年，在这种提案激活机制中，镍和钴离子很明显，未生成topakinon，以检查被预测的第一个预测的客厅 - 与Apo类型相结合。使用高能量加速器研究组织的同步加速器辐射光收集衍射强度数据，并确定结构。结果，很明显，三个组氨酸残基的羟基为配体，酪氨酸残基的排列接近钴和镍离子周围的四个侧面，铜离子是apo型强烈建议在分配排名时采用常规的四面结构。由此，我们得出的结论是，氧分子的激活是由于中间结构引起的氧化电位的增加，该结构接近铜离子的四个侧面分布。此外，还发现反应中间体被困在一个低温度的陷阱中，并进行了条件搜索以分析时间划分，并且可以在30％甘油中的液氮温度下收集衍射强度。作为未来研究的基本数据，该结构在110K中得到认可，并收集了结构数据。