極低温時間分割X線結晶構造解析による銅アミン酸化酵素の自己触媒活性化機構の研究

利用低温时间分辨X射线晶体结构分析研究铜胺氧化酶的自催化激活机制

基本信息

批准号：
09780525
负责人：
山口宏
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kwansei Gakuin University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

Arthrobacter globiformis由来のモノアミン酸化酵素は、生合成時にまず前駆体不活性型として合成され、活性部位に存在するTyr残基が、銅イオンと酸素の存在下で翻訳後修飾を受けトパキノンに変換され活性型に変化する。平成9年度の本酵素の前駆体不活性型(apo型)と活性化型(holo型)の構造決定により、活性化過程における構造変化は活性部位近傍のHis残基とトパキノンに変換されるTyr残基のみにおこることを明らかにした。さらに、それらの構造を踏まえて活性化機構を推定した。平成10年度は、この提唱した活性化機構中で、最初に銅イオンがとると予測した正四面体配位構造を確認するために、トパキノン生成が起こらないことが明らかであるニッケル及びコバルトイオンを銅イオンの代わりにapo型に結合させた結晶を作製し、高エネルギー加速器研究機構のシンクロトロン放射光を用いて回折強度データを収集し、それらの構造を決定した。その結果、配位子となるべき3つのヒスチジン残基とチロシン残基の水酸基は、コバルト及びニッケルイオンの回りに正四面体に近い配置を持っていることが明らかになり、銅イオンがapo型に配位するとき最初に正四面体構造をとることを強く示唆した。この事より、酸素分子の活性化は、銅イオンの四面体配位に近い中間体構造による、酸化還元電位の上昇にあると結論づけた。また、反応中間体を低温トラップし、時間分割解析するための条件検索を行い、30%グリセロール存在下で液体窒素温度での回折強度収集ができることを明らかにした。今後の研究の基礎データとして、110Kにおいて、apo型、holo型のデータ収集を行い構造を精密化した。

在生物合成过程中，首先将源自关节杆菌的单胺氧化酶合成为前体无活性形式，而在活性部位中存在的Tyr残基在存在后经过铜离子和氧气的情况下进行了翻译后修饰，并将其转化为甲喹酮以成为活跃形式。通过确定1997年这种酶的前体 - 活性（APO）和激活（HOLO）形式的结构，揭示了激活过程中的结构变化仅发生在他的活性位点附近的残基和Tyr残基转换为topaquinone的残基处。此外，基于这些结构估算了激活机制。 In fiscal 1998, in order to confirm the tetrahedral coordination structure that copper ions were first predicted to be taken in the activation mechanism proposed, we fabricated crystals in which nickel and cobalt ions, which are clearly not to be produced, were bound to the APO type instead of copper ions, and diffraction intensity data was collected using synchrotron radiation from the High Energy Accelerator Research Institute, and their structures were determined.结果表明，三个组氨酸残基的羟基和应为配体的酪氨酸残基在钴和镍离子周围具有近四面体排列，这强烈表明铜离子在坐标为APO类型时首先采用四面体结构。这得出的结论是，氧分子的激活是由于氧化 - 雷克斯电位的增加，这是由于接近铜离子四面体配位的中间结构引起的。此外，搜索条件是否在低温和时间细分的分析中捕获的反应中间体，并且发现在30％甘油存在下，衍射强度在液氮温度下收集。作为未来研究的基本数据，在110K处收集Apo类型和Holo类型数据，以完善结构。