銅含有アミン酸化酵素のトパキノン生成過程の構造学的研究

含铜胺氧化酶生产托帕醌工艺的结构研究

基本信息

批准号：
13780539
负责人：
山口宏
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kwansei Gakuin University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

近年、遺伝子中では一般のアミノ酸としてコードされ、翻訳後修飾により補酵素に変換されて酵素反応に用いられるビルトイン補酵素が見つかってきた。Arthrobacter Globiformis由来フェニルエチルアミン酸化酵素中のビルトイン補酵素であるトパキノンは、銅イオンと酸素の存在下でその前駆体中のチロシン残基の酸化的修飾によって生成する。この生成機構を解明するため、結晶中でトパキノン生成反応を制御し、反応中間体を低温トラップし、それらの構造決定を行った。まず、前駆体アポ型酵素を厳密な嫌気条件下で結晶化した。得られた結晶を硫酸銅と抗凍結剤であるグリセロールを含んだ溶液に移し、銅イオンが結合した初期中間体を含む結晶を作成し(Bio1)、液体窒素温度で中間体をトラップした。次に、この銅結合型の結晶を空気飽和した結晶母液に移した後、10分後(Bio2)、100分後(Bio3)及び3日後(Bolo)に同じように液体窒素温度で反応を止め、結晶を保存した。これらの結晶中での反応の進行状況を顕微分光で確認し、Holoのみトパキノンが生成していることを確認した。次に、これらの結晶のX線回折強度イメージをSPring8の放射光を用い、BL44XU、BL44B2のCCD検出器で記録し、構造を決定した。その結果、Bio1は3つのHis残基とTyr残基のOHが銅イオンにテトラヘドラルな配位をしている中間体構造が明らかになった。Bio2では、新たに一つの酸素原子のみがTyr残基に共有結合しているドーパキノンを持つ中間体の構造が決定できた。さらに、Bio3で解析した中間体構造は、トパキノンと同じく3つの酸素原子がリングに共有結合しており、付加された酸素原子の一つが主鎖の酸素原子と水素結合していることから、還元型であると決定した。3日間反応を進行させたHoloでは、トパキノンが生成しており反応が完結していることが明らかになった。Bio2からBio3への過程およびBio3からHoloへの過程で環の回転が確認され、これらの結果に基づき、詳細なトパキノン生成の反応機構について明らかにした。

近年来，人们发现内建辅酶在基因中编码为通用氨基酸，通过翻译后修饰转化为辅酶，并用于酶促反应。托帕醌是球状节杆菌苯乙胺氧化酶的内置辅酶，是通过在铜离子和氧存在下对其前体中的酪氨酸残基进行氧化修饰而产生的。为了阐明这种形成机制，我们控制了晶体中的托帕醌形成反应，在低温下捕获了反应中间体，并确定了它们的结构。首先，前体脱辅基型酶在严格的厌氧条件下结晶。将所得晶体转移至含有硫酸铜和甘油（一种冷冻保护剂）的溶液中，以产生含有与铜离子（Bio1）结合的初始中间体的晶体，并在液氮温度下捕获该中间体。接下来，将该铜键合晶体转移至空气饱和的晶体母液中后，在液氮温度下同样地在10分钟(Bio2)、100分钟(Bio3)、3天(Bolo)后停止反应。，晶体被保存下来。使用显微分光法确认了这些晶体中的反应进程，并且确认了托帕醌仅在Holo中产生。接下来，使用 SPring 8 的同步辐射和 BL44XU 和 BL44B2 上的 CCD 探测器记录这些晶体的 X 射线衍射强度图像，并确定它们的结构。结果表明，Bio1具有三个His残基和Tyr残基的OH与铜离子四面体配位的中间结构。在 Bio2 中，我们能够确定一种新的多巴醌中间体的结构，其中只有一个氧原子与 Tyr 残基共价键合。另外，根据Bio3分析的中间体结构可知，与托帕醌一样，环上共价键合有3个氧原子，其中1个氧原子与主链的氧原子具有氢键。一种类型。 Holo让反应进行三天，很明显产生了托帕醌，表明反应完成。从Bio2到Bio3以及从Bio3到Holo的过程中确认了环旋转，并且基于这些结果，阐明了托帕醌生产的详细反应机理。