銅含有アミン酸化酵素のトパキノン生成過程の構造学的研究

含铜胺氧化酶生产托帕醌工艺的结构研究

基本信息

批准号：
13780539
负责人：
山口宏
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kwansei Gakuin University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

近年、遺伝子中では一般のアミノ酸としてコードされ、翻訳後修飾により補酵素に変換されて酵素反応に用いられるビルトイン補酵素が見つかってきた。Arthrobacter Globiformis由来フェニルエチルアミン酸化酵素中のビルトイン補酵素であるトパキノンは、銅イオンと酸素の存在下でその前駆体中のチロシン残基の酸化的修飾によって生成する。この生成機構を解明するため、結晶中でトパキノン生成反応を制御し、反応中間体を低温トラップし、それらの構造決定を行った。まず、前駆体アポ型酵素を厳密な嫌気条件下で結晶化した。得られた結晶を硫酸銅と抗凍結剤であるグリセロールを含んだ溶液に移し、銅イオンが結合した初期中間体を含む結晶を作成し(Bio1)、液体窒素温度で中間体をトラップした。次に、この銅結合型の結晶を空気飽和した結晶母液に移した後、10分後(Bio2)、100分後(Bio3)及び3日後(Bolo)に同じように液体窒素温度で反応を止め、結晶を保存した。これらの結晶中での反応の進行状況を顕微分光で確認し、Holoのみトパキノンが生成していることを確認した。次に、これらの結晶のX線回折強度イメージをSPring8の放射光を用い、BL44XU、BL44B2のCCD検出器で記録し、構造を決定した。その結果、Bio1は3つのHis残基とTyr残基のOHが銅イオンにテトラヘドラルな配位をしている中間体構造が明らかになった。Bio2では、新たに一つの酸素原子のみがTyr残基に共有結合しているドーパキノンを持つ中間体の構造が決定できた。さらに、Bio3で解析した中間体構造は、トパキノンと同じく3つの酸素原子がリングに共有結合しており、付加された酸素原子の一つが主鎖の酸素原子と水素結合していることから、還元型であると決定した。3日間反応を進行させたHoloでは、トパキノンが生成しており反応が完結していることが明らかになった。Bio2からBio3への過程およびBio3からHoloへの過程で環の回転が確認され、これらの結果に基づき、詳細なトパキノン生成の反応機構について明らかにした。

近年来，已经发现了基因中的一般氨基酸的内置辅酶，并通过翻译后修饰转化为辅酶，并用于酶促反应。拓基酮是苯甲胺氧化酶的一种内置辅酶，来自节肢动杆菌的苯胺氧化酶，是通过在铜离子和氧气的存在下在其前体中酪氨酸残基的氧化修饰而产生的。为了阐明这种形成机理，在晶体中控制了甲喹酮的形成反应，并在低温下将反应中间体捕获以确定其结构。首先，在严格的厌氧条件下将前体的APO型酶结晶。将所得的晶体转移到含有硫酸铜和甘油（抗甘油原）的溶液中，以制备包含铜离子结合的初始中间体（BIO1）的晶体（BIO1），并将中间体捕获在液氮温度下。接下来，将铜键的晶体转移到空气饱和的晶体母亲酒中，并在10分钟（BIO2），100分钟（Bio3）和3天（Bolo）（Bolo）以相同的液态氮温度停止反应，并存储晶体。通过微观光谱证实了这些晶体中反应的进展，并且证实只有Holo产生了甲喹酮。接下来，使用Spring8的同步辐射和BL44XU和BL44B2的CCD检测器记录了这些晶体的X射线衍射强度图像，并确定了结构。结果，揭示了Bio1具有中间结构，其中三个残留物和Tyr残基的OH以四面体方式与铜离子坐标。在Bio2中，确定了仅与Tyr残基共价结合的中间体的结构，其中仅一个氧原子与Tyr残基结合。此外，由于三个氧原子与topakinones一样，由Bio3分析的中间结构被确定为减少，因为三个氧原子与topakinones键合成，并且添加的氧原子之一是氢粘合到主链中的氧原子。在已经反应3天的Holo中，据透露已经产生了甲喹酮，并且反应已经完成。在从Bio2到Bio3的过程中确认了环旋转，并从Bio3到Holo，根据这些结果，阐明了形成甲喹酮的详细反应机制。