ウイルス感染によって誘導される新たなシグナル伝達経路の解析

病毒感染诱导的新信号转导途径分析

基本信息

批准号：
11770165
负责人：
米山光俊
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11770165/
关键词：
インターフェロン IRF-3 転写制御シグナル伝達

项目摘要

これまでに、ウイルス感染あるいは二重鎖RNA刺激によって伝達されるシグナル伝達により、転写因子IRF-3はリン酸化され、核へ移行し、二量体を形成すると共にコアクチベーターであるp300/CBPと複合体を形成することにより、特異的なDNA結合能を獲得し、I型インターフェロン遺伝子の発現誘導に直接関与することを明らかにしてきた。この新しいシグナル伝達経路は、IRF-3のリン酸化が引き金になっていることが、昨年度までの解析から明らかになっていることから、このリン酸化に関わるキナーゼ分子の同定が重要な研究課題になってきていた。そこで本年度は、昨年度までに明らかにしてきたIRF-3の活性化に必須なC末端に存在する二つのセリン残基に焦点を絞り、in vitroでのリン酸化反応系の構築を行ってきた。その結果、ヒトHeLa細胞から調製した細胞抽出液を試料とし、IRF-3のC末端部分を大腸菌に発現させて部分的に精製したもの、あるいは同様の配列をもつ合成ペプチドを基質として用いることにより、in vitroでのリン酸化を観察することに成功した。また、上記の2つのセリン残基を他のアミノ酸残基に置換した変異型IRF-3を基質として用いた実験から、観察されたリン酸化がこれら2つのセリン残基に特異的に起きていることも確認した。そこで現在、このリン酸化反応系を指標として、大量に調製したHeLa細胞抽出液から、リン酸化に関わるキナーゼ分子の精製、単離を試みている。

迄今为止，转录因子IRF-3通过病毒感染或双链RNA刺激的信号转导而被磷酸化，转位至细胞核，形成二聚体，并与共激活剂p300/CBP形成复合物，它具有特异的DNA结合能力，直接参与诱导I型干扰素基因表达。截至去年的分析表明，这种新的信号转导途径是由IRF-3的磷酸化触发的，使得鉴定参与这种磷酸化的激酶分子成为一个重要的研究课题。因此，今年我们重点关注去年发现的IRF-3激活所必需的C末端两个丝氨酸残基，构建了体外磷酸化反应体系。结果，我们使用从人HeLa细胞制备的细胞提取物作为样品，在大肠杆菌中表达IRF-3的C末端部分并对其进行部分纯化，或者使用具有相似序列的合成肽作为底物，我们在体外成功观察到磷酸化。另外，使用其中上述两个丝氨酸残基被其他氨基酸残基取代的突变体IRF-3的实验表明，观察到的磷酸化特异性地发生在这两个丝氨酸残基上。因此，我们目前正在尝试以该磷酸化反应体系为指标，从大量制备的HeLa细胞提取物中纯化分离出参与磷酸化的激酶分子。