大腸菌異物排出タンパク質の高次構造の解明

阐明大肠杆菌异生物质排泄蛋白的高级结构

• 批准号: 10771289
• 负责人: 染谷 雄一
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10771289/
• 关键词: 異物排出タンパク質; テトラサイクリン; テトラサイクリン排出タンパク質; 二次性性能動輸送体; 結晶化; 一次性能動輸送体; P-糖タンパク質; 融合タンパク質

生体異物排出タンパク質はすべての生物に見いだされている。本研究では、異物排出タンパク質の三次元立体構造の解明を目指し、以下の実験を行った。二次性能動輸送体の構造解明を目指し、大腸菌のテトラサイクリン排出タンパク質TetAを選択した。TetAは、抗生物質であるテトラサイクリンを細胞外に排出している。TetAを簡便にかつ大量に精製するために、TetAのC末端にHistidine-tagが付加するように改変したtetA遺伝子をlacプロモータ支配下に作成した。目的タンパク質が大量発現した大腸菌の膜画分を界面活性剤を用いて可溶化し、TetAをニッケルアフィニティレジンで精製した。精製TetAから三次元結晶を得るために、結晶化スクリーニングキットを用いてシッティングドロップ蒸気拡散法で結晶化条件の検索を行った。150種の条件の中から4つの条件でTetAの微結晶を得ることができた。今後は、条件を詳細に検討し、良質の結晶を得ることを目指す。また、これまで結晶化されている膜タンパク質が比較的親水性部分に富んでいることに着目し、TetAのN末端あるいはC末端に親水性タンパク質を融合させた。親水性タンパク質は、ジヒドロ葉酸還元酵素、β-ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチル転移酵素、グルタチオン-S-転移酵素を選択した。融合遺伝子をlacプロモータ支配下に作成した。いずれの融合タンパク質も大腸菌膜画分に大量発現したが、現在のところ、比較的高い活性を保持するジヒドロ葉酸還元酵素融合タンパク質をメトトレキセートレジンで精製し、結晶化条件を検討している。一次性能動輸送体の代表として、哺乳動物のP-糖タンパク質に類似した大腸菌のMdlABタンパク質を選び、その発現系の構築に成功した。今後、大量に精製し、結晶化条件を検討する。

异生元排泄蛋白在所有生物体中都发现。在这项研究中，进行了以下实验，目的是阐明异物排泄蛋白的三维三维结构。为了阐明次级性能转运蛋白的结构，我们选择了大肠杆菌四环素排泄蛋白TETA。 TETA排出细胞外的抗生素四环素。为了使TETA在方便而大量的位置净化TETA，在LAC启动子的控制下，创建了修改以在TETA的C端添加组氨酸标记的TETA基因。大肠杆菌的膜分数使用大量靶蛋白，使用表面活性剂溶解，用镍亲和树脂纯化TETA。为了从纯化的TETA获得三维晶体，使用坐式滴蒸气扩散方法使用结晶筛选试剂盒搜索结晶条件。在150种类型的条件中，在四个条件下获得了TETA的微晶。将来，我们的目标是详细考虑条件并获得高质量的晶体。此外，重点是以下事实：已经结晶的膜蛋白相对富含亲水性部分，将亲水性蛋白融合到TETA的N末端或C-末端。从二氢叶酸还原酶，β-内酰胺酶，氯霉素乙酰转移酶和谷胱甘肽-S-转移酶中选择亲水蛋白。融合基因是在LAC启动子的控制下创建的。尽管两种融合蛋白在大肠杆菌膜分数中均以大量表达，但目前，使用甲氨蝶呤树脂纯化了二氢叶酸还原酶融合蛋白，并使用甲氨蝶呤的树脂纯化了相对较高的活性，并研究了结晶条件。作为主要性能转运蛋白的代表，我们选择了类似于哺乳动物P-糖蛋白的大肠杆菌MDLAB蛋白，并成功地为此构建了表达系统。将来，将通过质量纯化来检查结晶条件。