腸管出血性大腸菌O157ベロ毒素の関連ペプチドの合成及びその免疫化学的研究

肠出血性大肠杆菌O157维罗毒素相关肽的合成及免疫化学研究

• 批准号: 09772032
• 负责人: 藤原 洋一
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Kyoto Pharmaceutical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09772032/
• 关键词: 腸管出血性大腸菌; ベロ毒素; Fmoc型固相ペプチド合成; 抗原決定部位; キャリア蛋白; 抗体

平成10年度の研究実施結果について以下に述べる。本年度はVero毒素VT-2型のBサブユニットの関連ペプチドの大量合成およびキャリヤータンパク質とのコンジゲートの条件の最適化並びに各々のモノクロナール抗体を得ようと実験を行った.1. 腸管出血性大腸菌0157:H7の毒素,VT-2型のB鎖の関連ペプチドの合成を行った.Vero毒素VT2型B鎖のどの部分を免疫源として選択するかについて,幾つかのN末端部(16残基),数種類の中央部,さらにC末端部(14残基)の関連ペプチドの化学合成を行った.2. 化学合成に関して,実際にはFmoc法にて目的の保護ペプチド樹脂の構築を行った。保護ペプチド樹脂の脱保護に関しては,この際,テトラフルオロホウ酸法[J.Chem.Soc.,Chem.Commun.,1990,288]あるいはTFA法を用いて最終脱保護を行い,最終的に分取HPLCにて精製することでほぼ満足のいく収率で目的の関連ペプチドを得た。しかしながら,この際得られたC末端部あるいは中央部分の41-55位相当する部分での関連ペプチドではH_2O対する溶解性が極端に悪いため,この後行う予定であるキャリヤータンパク質と複合体形成が困難な状況となった.3. 比較的H_2O対する溶解性が良好な関連ペプチドに関しては溶媒にH_2Oを用いて水溶性カルボジイミド法にてキャリヤータンパク質であるウシサイログロブリンと効率的に結合させた抗原ペプチド蛋白複合体を合成できた.また,前述の問題のあるペプチドに関しては溶媒を検討し,ジメチルスルホキシドとH_2Oの混液を用いることで何とか溶解性の問題を解決することができた。しかしながら,当初の予定であったモノクローナル抗体の作成までには至らなかった。今後もこれらの基礎データを元に抗原決定部位の検索のための実験を行っていく予定である。

1998年进行的研究结果如下。今年，我们进行了实验，合成了大量Vero毒素VT-2型B亚基相关肽，优化了与载体蛋白的缀合条件，并获得了各自的单克隆抗体。1．我们合成了与肠出血性大肠杆菌 0157:H7 毒素 VT-2 型的 B 链相关的肽。关于应选择 Vero 毒素 VT2 型 B 链的哪一部分作为免疫原，合成了几个 N 端部分。 16个残基），几种类型的中心区域，和C末端区域（14个残基）相关的肽被化学合成。 2.关于化学合成，我们实际上使用Fmoc方法构建了所需的受保护的肽树脂。对于受保护的肽树脂的脱保护，使用四氟硼酸法[J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，1990，288]或TFA法进行最终的脱保护，并进行最终的分离。通过使用制备型 HPLC 纯化，以几乎令人满意的收率获得了相关肽。但此时得到的相关肽在C末端或中心部分对应41-55位的位置在H_2O中的溶解度极差，难以与将要进行的载体蛋白形成复合物后来的情况是3。对于在H_2O中具有相对良好溶解度的相关肽，我们能够以H_2O为溶剂通过水溶性碳二亚胺方法合成与载体蛋白牛甲状腺球蛋白有效结合的抗原-肽-蛋白质复合物。如上所述，我们研究了溶剂并通过使用二甲基亚砜和H_2O的混合物设法解决了溶解度问题。然而，他们未能按原计划制造单克隆抗体。我们计划根据这些基础数据继续进行实验寻找抗原决定位点。

项目成果

H.Michibata: "Autocrine/Paracrine Role of Adrenomedullin in Cultured Endothelial and Mesangial Cells." Kidney International. 53. 979-985 (1998)

H.Michibata：“肾上腺髓质素在培养的内皮细胞和系膜细胞中的自分泌/旁分泌作用。”