腎尿細管上皮細胞における薬物輸送担体の細胞膜局在性と細胞膜ソーティング機構の解析

肾小管上皮细胞药物转运载体的细胞膜定位及细胞膜分选机制分析

基本信息

批准号：
09771975
负责人：
桂敏也
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

ペプチドトランスポータ(PEPT1)は小腸や腎臓に発現し、小分子ペプチドやペプチド類似薬物の吸収に重要な役割を果たしている。しかしその細胞膜局在性や細胞膜発現機構については未だ不明な点が多い。本研究では腎尿細管上皮細胞におけるPEPT1の細胞膜局在性とその細胞膜発現機構を解明することを目的として、抗PEPT1抗体を用いた免疫化学的解析を計画した。昨年度は、ラット腎臓におけるPEPT1の細胞膜局在性と尿細管分布について明らかにした。さらにPEPT1の細胞膜発現機構を精査するため、培養腎上皮細胞LLC-PK1にPEPT1を発現させたPEPT1安定発現細胞、LLC-rPEPT1を用いた細胞生物学的解析を行った。この細胞において、PEPT1が頂側膜側優位ながら両細胞膜に発現していることは既に確認済みであり、細胞膜発現機構の解析に有用なモデルであると考えられた。LLC-rPEPT1細胞を[^<35>S]Met-Cysを用いて短時間標識し、パルス-チェイス実験を行うことによって生合成後のPEPT1の細胞膜への輸送を解析したところ、新たに生合成されたPEPTlは方向非選択的に頂側膜及び側底膜に同程度輸送されることが明らかになった。さらに各々の細胞膜に発現後のPEPT1の挙動について解析したところ、側底膜に発現したPEPT1の消失が頂側膜に発現したものに比べてより早く、両細胞膜に移行後のPEPT1の挙動に違いが認められることが明らかになった。さらにこの違いが、PEPT1の分解速度に起因することが示唆された。現在、PEPT1の活性制御因子であると考えられているPEPT1-RFを共発現させた細胞を構築中であり、この制御因子がPEPT1の細胞膜発現に及ぼす影響について検討する予定である。

肽转运蛋白（PEPT1）在小肠和肾脏中表达，在小分子肽和肽类药物的吸收中发挥重要作用。然而，其细胞膜定位和细胞膜表达机制仍存在许多未知数。在本研究中，我们计划使用抗PEPT1抗体进行免疫化学分析，旨在阐明PEPT1在肾小管上皮细胞中的细胞膜定位及其细胞膜表达机制。去年，我们阐明了PEPT1在大鼠肾脏中的细胞膜定位和肾小管分布。此外，为了研究PEPT1的细胞膜表达机制，我们使用LLC-rPEPT1进行细胞生物学分析，LLC-rPEPT1是一种稳定的PEPT1表达细胞，其中PEPT1在培养的肾上皮细胞LLC-PK1中表达。在这些细胞中，已经证实PEPT1在两个细胞膜上都表达，尽管它主要在顶膜侧表达，并且该模型被认为对于分析细胞膜表达机制是有用的。 LLC-rPEPT1细胞用[^ 35 S]Met-Cys简单标记，并进行脉冲追踪实验以分析生物合成后PEPT1向细胞膜的转运。结果表明，PEPT1被定向非选择性地转运至细胞膜。顶膜和基底膜的程度相同。此外，我们分析了PEPT1在各细胞膜表达后的行为，发现在基底外侧膜表达的PEPT1比在顶膜表达的PEPT1消失得更快，这表明PEPT1在表达后的行为存在差异。很明显，这是可以接受的。此外，有人认为这种差异是由于 PEPT1 的降解率造成的。我们目前正在构建共表达 PEPT1-RF 的细胞，PEPT1-RF 被认为是 PEPT1 的活性调节因子，并计划研究该调节因子对 PEPT1 细胞膜表达的影响。