極性上皮細胞における有機イオントランスポータの細胞膜局在化機構の解明

阐明极化上皮细胞中有机离子转运蛋白的膜定位机制

基本信息

批准号：
15790093
负责人：
桂敏也
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

小腸や腎臓などの極性上皮細胞では、血管側側底膜と管腔側刷子縁膜に機能特性の異なる有機イオントランスポータが局在し、薬物輸送の方向性(吸収・分泌)の決定に重要な役割を果たしている。しかし、これら有機イオントランスポータの細胞膜局在化機構については未だ不明な点が多い。本研究では、薬物トランスポータとしてペプチドトランスポータ(PEPT1)を選択し、蛍光蛋白質(EGFP)との融合蛋白質として極性上皮細胞LLC-PK_1に安定発現させ、PEPT1の細胞膜局在化機構について検討を加えた。PEPT1のC末端側アミノ酸3残基(PDZドメインによって認識されうる配列:PDZ-interacting domain)を欠失させた場合、主にライソゾームと側底膜に局在が認められ、主に頂側膜に発現している野生型とは明らかに異なっていた。従って、PEPT1のPDZ-interacting domainが細胞膜局在に関与していることが考えられ、その機構について詳細に解析した。パルス-チェイス法と細胞表面ビオチン化により生合成後のPEPT1の細胞膜発現挙動について検討したところ、PEPT1変異体も野生型と同様に頂側膜へ輸送されるものの、頂側膜に発現後の消失が野生型に比べて速く、速やかに内在化していることが明らかとなった。以上の結果より、PEPT1のC末端側3残基を欠失させることによって、選別過程や輸送過程には影響が認められないものの、頂側膜における保持機構に影響することが示唆された。PEPT1と相互作用するPDZ蛋白質は現時点では不明であるが、PEPT1のPDZ-interacting domainを介した蛋白質相互作用によって頂側膜においてPEPT1が保持されるものと考えられる。

在小肠和肾脏等极化上皮细胞中，具有不同功能特征的有机离子转运蛋白定位于血管侧的基底外侧膜和管腔侧的刷状缘膜，对于确定药物转运方向具有重要意义（吸收/分泌）。然而，这些有机离子转运蛋白的细胞膜定位机制仍然存在许多未知数。在本研究中，我们选择肽转运蛋白（PEPT1）作为药物转运蛋白，将其作为与荧光蛋白（EGFP）的融合蛋白在极化上皮细胞LLC-PK_1中稳定表达，并研究PEPT1 Ta的细胞膜定位机制。。当PEPT1的三个C末端氨基酸残基（可以被PDZ结构域识别的序列：PDZ相互作用结构域）被删除时，主要在溶酶体和基底外侧膜中观察到定位，并且主要在顶膜中观察到。与表达的野生型明显不同。因此，认为PEPT1的PDZ相互作用结构域参与了细胞膜定位，并对其机制进行了详细分析。当我们使用脉冲追踪法和细胞表面生物素化检查生物合成后PEPT1的细胞膜表达行为时，我们发现PEPT1突变体像野生型一样被转运到顶膜，但在顶膜中表达后消失。比野生型更快更迅速地被内在化。上述结果表明PEPT1的三个C端残基的缺失并不影响分选或运输过程，但确实影响顶膜中的保留机制。尽管与 PEPT1 相互作用的 PDZ 蛋白目前尚不清楚，但人们认为 PEPT1 通过 PEPT1 的 PDZ 相互作用结构域介导的蛋白质相互作用保留在顶膜中。