胃プロトンポンプのイオン認識、能動輸送機構の解明

阐明胃质子泵的离子识别和主动转运机制

基本信息

批准号：
09771973
负责人：
浅野真司
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Toyama Medical and Pharmaceutical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

胃H^+,K^+-ATPaseは胃酸の分泌を行うプロトンポンプであり、消化性潰瘍治療剤であるプロトンポンプインヒビター(PPI)の標的酵素である。本研究ではH^+,K^+-ATPaseのイオン認識部位、PPIの反応部位を、部位特異的な変異体、異種ポンプ分子間でのキメラ体を作製してそれらの機能を比較、解析することによって決定した。また、大腸のプロトンポンプを培養細胞に発現させて、その機能を解析した。1. K^+-競合型PPIの反応部位の検索:K^+-競合型阻害剤であるSCH 28080の反応部位がH^+,K^+-ATPaseの触媒サブユニットの6番目の膜貫通領域近傍にあること。SCH28080の反応部位が一次構造上でもK^+の認識部位に近い、または一部重複することを見いだした。また、H^+,K^+-ATPaseにNa^+,K^+-ATPaseの構造を移植する形で、PPIに対してもNa^+,K^+-ATPase阻害剤であるウワバインにも感受性を示す新規のキメラポンプを作製した。2. プロトンポンプのイオン認識部位の決定: H^+,K^+-ATPaseの触媒サブユニットの4番目、6番目の膜貫通領域中の酸性アミノ酸残基(Glu-345,Glu-822,Asp-826)がK^+の認識部位であることを見いだした。さらに、6番目の膜貫通領域の疎水性アミノ酸残基の変異実験から、αヘリックスの片側にK^+の認識や酵素活性の維持に必須のアミノ酸残基が集中して、イオン輸送路のような構造を取ることを確認した。3. 大腸のプロトンポンプの機能的な発現: 胃プロトンポンプのアイソフォームである大腸のH^+,K^+-ATPaseのcDNAを培養細胞に導入してATPase分子を細胞膜上に発現させた。さらに、ポンプのイオン感受性、阻害剤感受性を検討して、このポンプがH^+,K^+-ATPaseとNa^+,K^+-ATPaseとの中間的な性質を持つことを確認した。

胃H^+,K^+-ATP酶是分泌胃酸的质子泵，是消化性溃疡治疗剂质子泵抑制剂（PPI）的靶酶。在本研究中，我们将针对H^+,K^+-ATPase的离子识别位点和PPI的反应位点，在不同泵分子之间创建位点特异性突变体和嵌合体，并比较和分析它们的功能。这。我们还在培养细胞中表达了结肠质子泵并分析了其功能。 1.寻找K^+竞争性PPI的反应位点：K^+竞争性抑制剂SCH 28080的反应位点是H^+,K^+-ATPase Must催化亚基的第6次跨膜。靠近该区域。我们发现SCH28080的反应位点与一级结构中的K^+识别位点接近或部分重叠。此外，通过将Na^+,K^+-ATPase的结构移植到H^+,K^+-ATPase，已被证明对PPI以及哇巴因（Na^+,K）有效^+-ATP酶抑制剂。我们创造了一种新的敏感嵌合泵。 2.质子泵离子识别位点的确定：发现酸性氨基酸残基(Glu-345、Glu-822、Asp -826)是K^+的识别位点。此外，第六跨膜区疏水性氨基酸残基的突变实验表明，K^+识别和维持酶活性所必需的氨基酸残基集中在α-螺旋的一侧，形成离子转运途径。它具有类似的结构。 3.大肠质子泵的功能表达：将胃质子泵的亚型大肠H^+,K^+-ATPase的cDNA导入培养细胞中表达ATPase分子在细胞膜上。此外，我们还检查了泵的离子敏感性和抑制剂敏感性，并证实该泵具有介于 H^+,K^+-ATPase 和 Na^+,K^+-ATPase 之间的特性。