H^+,K^+‐ATPaseファミリーの構造-機能相関についての分子生物学的研究

H^+,K^+-ATPase家族结构与功能关系的分子生物学研究

基本信息

批准号：
07772159
负责人：
浅野真司
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Toyama Medical and Pharmaceutical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.胃H^+,K^+‐ATPaseの機能的な発現について胃H^+,K^+‐ATPaseは胃酸の分泌に携わるプロトンポンプである。これまで、このポンプについてはcDNAを機能的に発現することができなかったため、ポンプの構造と機能との関連についての研究が進んでいなかった。私は、ウサギの胃H^+,K^+‐ATPaseのα、βサブユニットのcDNAに修飾を施したのち、ヒト腎臓由来の培養細胞、HEK‐293に導入することによってこのATPaseを機能的に発現させることに成功した。2.胃H^+,K^+‐ATPaseの触媒中心やイオン認識部位への部位特異的な変異導入について前項に述べた機能的な発現系を用いて、H^+,K^+‐ATPaseの触媒中心やイオン認識部位に変異を導入し、その機能的な変化を観察した。触媒中心にリン酸化部位(Asp‐387)に変異を導入すると、変異体はすべて活性を失った。Asp→Gluという形でカルボキシル基を保持して側鎖の大きさを変えただけでも失活がおこった。このことから、リン酸化部位には厳格な一定の構造が要求されるものと考えられた。また、αサブユニットの4番目の膜貫通領域(M4)に存在するグルタミン酸残基(Glu‐345)に変異を導入すると、多くの変異体は活性を完全に失ったが、グルタミン変異体(E345Q)は、野生型の約40%の活性を保持した。この変異体は、K^+に対する親和性が低下するとともに、ATPに対する親和性が上昇していた。このことから、Glu‐345がK^+の認識に関与していること、またGlu‐345と原形質側のリン酸化部位Asp387、ATP結合部位Lys‐519をつなぐM4セグメントがATPの加水分解とイオンの認識、輸送とを結びつけるエネルギー伝達に重要な役割を果たすものと考えられた。

1.胃H^+,K^+-ATP酶的功能表达胃H^+,K^+-ATP酶是参与胃酸分泌的质子泵。迄今为止，还无法功能性表达该泵的cDNA，因此对泵结构与功能之间关系的研究尚未取得进展。我对兔胃H^+,K^+-ATP酶的α和β亚基的cDNA进行了修饰，然后将其导入人肾来源的培养细胞HEK-293中，使该ATP酶成功表达。 2.在胃H^+,K^+-ATPase的催化中心和离子识别位点引入位点特异性突变利用上一节中描述的功能表达系统，在H^+,K^+-ATPase中引入突变在蛋白质的催化中心和离子识别位点观察其功能变化。当在催化中心的磷酸化位点（Asp-387）引入突变时，所有突变体都失去了活性。即使通过保留 Asp→Glu 格式的羧基来改变侧链的大小，也会发生失活。这表明磷酸化位点需要严格的、固定的结构。此外，当将突变引入α亚基第四跨膜区（M4）中的谷氨酸残基（Glu-345）时，许多突变体完全失去活性，但谷氨酰胺突变体（E345Q）保留了大约40%的活性。野生型的活性。该突变体对 K^+ 的亲和力降低，对 ATP 的亲和力增加。这表明Glu-345参与K^+识别，并且连接Glu-345与Asp387（血浆侧磷酸化位点）和Lys-519（ATP结合位点）的M4片段参与ATP水解人们认为它在连接离子识别和运输的能量传递中发挥着重要作用。