水疱症をモデルとした細胞骨格・細胞接着制御におけるプロテインキナーゼCの役割

蛋白激酶 C 在大疱性疾病模型中调节细胞骨架和细胞粘附的作用

基本信息

批准号：
09770623
负责人：
江崎智香子
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Gifu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09770623/
关键词：
PKC PKM ケラチン水疱症

项目摘要

細胞骨格・細胞接着系の構造分子は細胞外シグナルに対応し、細胞の分化増殖に深く関わっている。自己免疫性水疱症の1つである天疱瘡の水疱形成メカニズムにおいて、カルシウム依存性シグナル伝達とホスホリパーゼCの関与、プロテインキナーゼC(PKC)各アイソザイム間の発現および活性動態の差が示されてきた。本研究は、表皮細胞の細胞骨格・接着の動体構造に関してその障害である水疱症をモデルとし、天疱瘡抗体によって惹起される細胞骨格・細胞接着系の構造分子、特にケラチンおよびデスモソーム構造分子のPKCによるリン酸化を検討し、PKCによる機能的制御機構を、基礎的細胞生物学的に解明しようとするものである。本年度は、PKCの活性化を誘導すると考えられているホルボールエステルの1つである12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate(TPA)を刺激として、ヒト有棘細胞癌由来培養DJM-1細胞におけるPKCおよびPKM(PKCの調節部分を欠いた活性部分Mキナーゼ)の局在を、PKCアイソザイム抗体を用いたウェスタンブロッティング法によって検討した。その結果、PKCαおよびηに対する抗体でPKMは検出されたが、PKCδおよびεには検出されなかった。PKMαは、細胞質、細胞膜、細胞骨格画分すべてに存在したが、PKMηは細胞質画分のみで観察された。さらにDEAE-Sephacel columnによってPKCとPKMを分離し各々の活性を測定したところ、細胞質画分において二峰性の活性がみられ、モノクローナル抗PKCa抗体を添加することにより活性の抑制がみられた。次いで、高濃度KCl不溶性画分(ケラチン画分)におけるPKCの発現とPKC活性の検討を行い、ケラチン画分でのPKCaおよびPKMa、PKCeの存在を観察した。以上より、ヒト表皮細胞において、PKMαおよびηが存在し、それらはリン酸化能を保持し、PKCおよびPKMがケラチン蛋白リン酸化制御に関与する可能性が示唆された。

细胞骨架和细胞粘附系统的结构分子响应细胞外信号，并深度参与细胞分化和增殖。在天疱疮（一种自身免疫性大疱性疾病）的起泡机制中，钙依赖性信号转导和磷脂酶 C 的参与以及蛋白激酶 C (PKC) 同工酶之间的表达和活性动力学差异已被证实。本研究以大疱性疾病为表皮细胞细胞骨架和粘附的动态结构模型，重点对天疱疮抗体诱导的细胞骨架和细胞粘附系统的结构分子，特别是角蛋白和桥粒结构分子的PKC进行研究。旨在从基础细胞生物学角度阐明 PKC 的功能控制机制。今年，我们使用 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯 (TPA)（一种被认为可诱导 PKC 激活的佛波酯）作为源自人鳞状细胞癌的培养 DJM-1 细胞的刺激物，以刺激 PKC 的定位。使用 PKC 同工酶抗体通过蛋白质印迹法研究 PKM（缺乏 PKC 调节部分的活性部分 M 激酶）。结果，使用针对 PKCα 和 η 的抗体检测到 PKM，但未检测到针对 PKCδ 和 ε 的抗体。 PKMα 存在于所有细胞质、细胞膜和细胞骨架部分中，而 PKMη 仅在细胞质部分中观察到。此外，当使用DEAE-Sephacel柱分离PKC和PKM并测量它们各自的活性时，在细胞质级分中观察到双峰活性，并且通过添加单克隆抗PKCa抗体抑制该活性。接下来，我们检查了高浓度KCl不溶组分（角蛋白组分）中PKC的表达和PKC活性，并观察角蛋白组分中PKCa、PKMa和PKCe的存在。上述结果提示PKMα和η存在于人表皮细胞中，保留磷酸化能力，PKC和PKM可能参与调节角蛋白磷酸化。