カブトガニ血球細胞中に含まれる体液凝固インヒビターの構造と機能の解析

鲎血细胞体液凝固抑制剂的结构与功能分析

• 批准号: 08780566
• 负责人: 三浦 芳樹
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kurume University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08780566/
• 关键词: セルピン; カブトガニ; インヒビター

カブトガニ血球細胞には複数のセリンプロテアーゼインヒビター(セルピン)が存在し、既に2種のLimulusIntracellular Coagulation Inhibitor (LICI) type-1,type-2の精製、クローニングが行われている。今回、LICI-1,-2とは特異性の異なるインヒビター(LICI-3と命名)の精製、クローニングを行った。LICI-3はデキストラン硫酸セファロース、セファクリルS-200とpHの異なる2回のDEAEセファロースにより精製され、その分子量は53,000であった。LICI-1,-2がそれぞれカブトガニ体液凝固系セリンプロテアーゼC因子、凝固酵素を阻害するのに対し、LICI-3は真菌等の細胞壁の構成成分である(1,3)-β-D-glucanにより活性化されるセリンプロテアーゼG因子を最もよく阻害した(k_1=3.9x10^5M^<-1>s^<-1>)。精製LICI-3をリシルエンドペプチダーゼにより消化し、逆相系HPLCによりペプチドを分取の後、気相シーケンサーによりアミノ酸配列を決定した。得られたアミノ酸配列情報を元にプローブを作成し、カブトガニ血球cDNAライブラリーより、LICI-3のcDNAを得た。LICI-3はシグナル配列22残基、インヒビター部392残基よりなり、その反応部位の配列はArg-Serであった。相同性解析を行うとLICI-3は他のLICI同様にシグナル配列は持つものの白血球エラスターゼインヒビター(35%)等の細胞内セルピンと高い相同性を示した。各種臓器より調整したtotalRNAに対し、RT-PCRによりLICI-3の発現組織を調べると血球のみで特異的増幅がみられ、血球細胞以外の組織で発現していないと考えられた。次に血球内での局在を明らかにするために抗LICI-3抗体を用い、大・小顆粒画分に対しウェスタンブロティングを行った。抗LICI-3抗体は大顆粒画分に反応し、他のLICI同様に体液凝固系プロテアーゼと共に大顆粒中に存在し、リポ多糖などの刺激により細胞外へ放出されると考えられた。そこで血球細胞にカルシュウムイオノフォアA23187を加え、LICI-3の細胞外へ放出を調べるとイオノフォアにより細胞外に放出された。このことは構造上は細胞質に存在する細胞内セルピンに相同性が高いものの、シグナル配列を持ち顆粒内に存在し、刺激により細胞外に放出される点で大きく異なっていた。

鲎血细胞中存在多种丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpins），鲎细胞内凝血抑制剂（LICI）1型和2型两种类型已被纯化和克隆。这次，我们纯化并克隆了一种与LICI-1和-2具有不同特异性的抑制剂（命名为LICI-3）。 LICI-3经硫酸葡聚糖Sepharose、Sephacryl S-200、DEAE Sepharose在不同pH值下纯化两次，分子量为53,000。 LICI-1和-2抑制鲎体液凝固系统丝氨酸蛋白酶C因子和凝固酶，LICI-3抑制真菌细胞壁的成分(1,3)-β-D-葡聚糖等。它抑制大多数激活的丝氨酸蛋白酶G因子(k_1=3.9x10^5M^<-1>s^<-1>)。纯化的LICI-3用赖氨酰内肽酶消化，通过反相HPLC分级分离肽，并通过气相测序仪确定氨基酸序列。根据获得的氨基酸序列信息制作探针，并从鲎血细胞cDNA文库获得LICI-3 cDNA。 LICI-3由22个残基的信号序列和392个残基的抑制区组成，反应位点序列为Arg-Ser。同源性分析显示，LICI-3虽然与其他LICI一样具有信号序列，但与白细胞弹性蛋白酶抑制剂等细胞内丝氨酸蛋白酶抑制剂具有较高的同源性（35%）。当使用从各种器官制备的总RNA通过RT-PCR检查LICI-3的表达组织时，仅在血细胞中观察到特异性扩增，这表明它在血细胞以外的组织中不表达。接下来，为了澄清血细胞内的定位，使用抗LICI-3抗体对大颗粒级分和小颗粒级分进行蛋白质印迹。抗LICI-3抗体与大颗粒部分发生反应，并且与其他LICI一样，它被认为与体液凝固系统蛋白酶一起存在于大颗粒中，并在脂多糖刺激下释放到细胞外。因此，当我们将钙离子载体A23187添加到血细胞中并检查细胞中LICI-3的释放时，我们发现它是由离子载体从细胞中释放的。尽管这种结构与存在于细胞质中的细胞内丝氨酸蛋白酶抑制剂高度同源，但它有很大不同，因为它具有信号序列，驻留在颗粒内，并在刺激后释放到细胞外。

项目成果

Agarwala K.L.et al: "Limulus Intracellular Coagulation Inhibitor Type3" J.Biol.Chem. 271. 23768-23774 (1996)

Agarwala K.L. 等人：“鲎细胞内凝血抑制剂 3 型”J.Biol.Chem。