aly候補遺伝子の受精卵導入によるalymphoplasia症の回復試験

受精卵导入aly候选基因对发育不全症的恢复试验

• 批准号: 08770234
• 负责人: 北田 一博
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08770234/
• 关键词: 免疫不全; リンパ節; パイエル板; 胚中心; マウス; ミュータント; ポジショナルクローニング; BAC

ALYマウスは、全身のリンパ節欠損を主徴とする免疫不全ミュータントであり、その原因遺伝子吋aly(alymphoplasia)は、第11染色体上のセントロメアから約63cMの位置に存在する。申請者らは、既に、遺伝学的にaly遺伝子の存在が示されている約300kbpの全ゲノム領域を単離することに成功している。しかしながら、あらかじめ、このゲノムコンティグ中にaly遺伝子が含まれていることを、遺伝学的方法以外の手法で確認しておくことが好ましい。そこで、本研究においては、ALYマウス由来の受精卵にaly遺伝子座近傍のゲノムDNAを導入し、alymphoplasia症の回復性の検討を拭みた。まずトランスジェネシスによる回復性を検討した過去の文献を調査したところ、形態形成に関わるような発現制御が複雑である遺伝子の回復には、コスミドクローンでは発現調節領域のすべてを包含するには必ずしも充分でないことが判明した。続いて、ALYマウス由来の受精卵が凍結保存に耐え得るか否かを検討したところ、凍結融解後も80%以上の生存性を示し、かつ細胞膜がピペット注入に十分な強度を保持していることが判明した。そこで、aly遺伝子の存在が示されている約300kbpの全ゲノム領域を重複してカバーしているBACクローンを3クローン選択し、そのDNAをrare cutterであるNotIで消化後、ALYマウス由来の凍結受精卵にマイクロインジェクション法にて注入した。現在までに、48匹の産仔が得られている。しかしながら、その中に注入DNAがALYマウスゲノムに導入された個体は存在しなかった。現在もなお、BAC DNAの導入個体を得るべく、さらに条件設定を行いながら実験を継続中である。BACクローンを安定して受精卵に導入する系を確立できれば、今後、迅速な疾患原因遺伝子の同定も可能となることが期待される。

Aly小鼠是一种基于整个身体的淋巴结缺乏的免疫源突变体，其致病基因英寸英寸的Aly（Alymphoplasia）在第11个染色体上的Centromere约为63 cm。申请人已经成功地隔离了大约300 kbp的所有基因，这表明存在Aly基因。但是，最好确认ALY基因以遗传方法以外的其他方法中包含在该基因组关联中。因此，在这项研究中，在源自Aly小鼠的受精卵中引入了基因组DNA，并擦除了层状疾病的恢复。首先，对通过转基因进行恢复的过去文档的调查表明，宇宙克隆在基因恢复中的所有表达调整区域都具有与形式相关的表达控制的复杂性。 。接下来，当源自Aly小鼠的受精卵可以承受冰冻的保存时，它显示了冰冻融化后的80％以上的生存，并且细胞膜在移液器注射中具有足够的强度。因此，将大约300kbp的整个基因组面积重叠的三个克隆（表明存在Aly基因的存在）被应用于DNA，并消化DNA，并消化DNA并从Aly小鼠中冻结。通过微方法将其注入受精卵。迄今为止，已经获得了48只幼犬。但是，没有个人在Aly嘴基因组中引入注射的DNA。我们仍在继续实验，同时设置更多条件以获取BAC DNA的引入。如果一个稳定地将BAC克隆引入受精卵的系统，则可以在将来可以立即鉴定出疾病因果基因。