出芽酵母の細胞極性形成におけるアクチン再構成の分子機構の解析

酿酒酵母细胞极性形成过程中肌动蛋白重组的分子机制分析

基本信息

批准号：
12780529
负责人：
鎌田このみ
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

出芽酵母の細胞極性形成におけるアクチン再構成の分子機構を明らかにするために、本研究ではタイプIミオシンに注目して解析を行った。平成12年度において、タイプIミオシンの温度感受性変異株を作製し、それを用いてタイプIミオシンと遺伝学的相互作用する因子としてCDC50を同定した。CDC50遺伝子産物(Cdc50p)は、これまでにほとんど機能を明らかとされていないが、相同性のあるタンパク質が酵母からヒトまで真核生物に広く存在し、基本的な生命活動に重要な役割をしている可能性が示唆されている。平成13年度は、このCdc50pの機能についてさらに詳細に解析した。まず、Cdc50pの細胞内局在を検討したところ、Cdc50pは界面活性剤により可溶化される膜タンパク質であった。ショ糖密度勾配遠心による細胞分画、また、間接蛍光抗体法による免疫染色実験から、Cdc50pは後期エンドソームに局在することを明らかにした。次に、CDC50遺伝子破壊株(cdc50Δ)を用いて、Cdc50pの細胞内での役割を調べた。cdc50Δ変異株は低温において、野生型よりも丸く極性を失った形態を示し、また、多くの細胞は小さな芽を出した状態で増殖を停止する。この時の細胞の状態を、細胞生物学的に詳細に解析し、以下のことを明らかにした。1)アクチンの細胞内局在が異常となる。2)エンドサイトーシスの後半の過程である、液胞への輸送が異常となる。3)細胞極性形成に重要な役割を果たしていることが知られている因子である、Gic1p、Bni1pの細胞内局在が異常となる。これらのことから、Cdc50pは、後期エンドソームに局在し、細胞の極性形成に関わる因子の局在を直接的(あるいは間接的)に制御することを通して、細胞極性形成を調節している重要なタンパク質であることが示唆された。

为了阐明在发芽酵母中细胞极性形成过程中肌动蛋白重构的分子机制，该研究的重点是I型肌球蛋白。在2000年，产生了I型肌球蛋白的温度敏感突变菌株，CDC50被用来识别与I型肌球蛋白相互作用的因素。尽管迄今为止，CDC50基因产物（CDC50P）的功能很小，但有人建议同源蛋白在真核生物中广泛存在，从酵母到人类，并且在基本生活活动中可能起重要作用。在2001年，我们更详细地分析了该CDC50P的功能。首先，当我们研究Cdc50p的亚细胞定位时，我们发现Cdc50p是通过表面活性剂溶解的膜蛋白。使用间接荧光免疫染色的蔗糖密度梯度离心和免疫染色实验的细胞分馏表明，CDC50P位于晚期内体。接下来，使用CDC50基因破坏菌株（CDC50Δ）研究了CDC50P的细胞内作用。与低温下的野生型相比，Cdc50Δ突变体表现出比野生型的圆形和极性形态，并且许多细胞停止在小芽中生长。此时，从细胞生物学的角度详细分析了细胞状态，并阐明了以下细胞状态。 1）肌动蛋白的亚细胞定位变得异常。 2）内吞作用的后半部分，传输到液泡异常。 3）GIC1P和BNI1P的亚细胞定位（已知在细胞极性形成中起重要作用的因素）变得异常。这些表明Cdc50p是一种重要的蛋白质，可通过直接（或间接）内体的直接定位（或间接）定位，并直接（或间接）控制细胞极性形成的因素的定位。