光遺伝学とクライオ電子線トモグラフィーを用いた神経細胞極性形成期の細胞骨格研究

使用光遗传学和冷冻电子断层扫描进行神经元极性形成过程中的细胞骨架研究

• 批准号: 22K20680
• 负责人: 吉原 壮悟
• 金额: $ 1.83万
• 依托单位: Tokyo Medical and Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-08-31 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K20680/
• 关键词: 細胞骨格; クライオ電子線トモグラフィー; 光遺伝学; アクチン; 細胞極性; Rac1

脳の情報処理機能を司る神経細胞の極性形成には、アクチンや微小管などの細胞骨格ネットワークが重要な役割を担っている。しかし、現在の光学顕微鏡的実験系では、極性形成過程を細胞内で観察することは困難であり、その分子機構の解明はほとんど進んでいない。そこで本研究では、光遺伝学とクライオ電子線トモグラフィー(Cryo-ET)とを組み合わせたタイムラプスCryo-ET法により、細胞骨格ネットワークの微細な形態変化過程を捉え、極性の形成機序や疾患の発症原因を解明することを目的としている。クライオ電子線トモグラフィーによる細胞骨格ネットワークの超微細構造解明のためには、グリッド上への細胞播種密度や接着条件、およびグリッド浸漬凍結装置の種類やその設定などを慎重に検討することが重要である。そこで本年度は、まず野生型海馬神経細胞を用いてこれらを精査し、その最適条件を得た。次に、極性形成過程の観察を行うべく、F-actinの蛍光標識であるLifeact-EGFPに加えて、アクチン繊維のネットワークを形成させる光遺伝学ツールPA-Rac1を海馬神経細胞に導入した。そして光照射時間による、ネットワークの活性化を定量的に解析した。得られたデータを用いて、Rac1活性化のタイムコースを設けた試料を浸漬凍結装置Vitrobotによって急速凍結し、様々な時期の試料を得ることに成功した。そして、試料を凍結したまま観察可能なクライオ蛍光顕微鏡Cryo EM CLEMを用いてグリッド全体を撮影し、PA-Rac1の発現と、Lifeact-EGFPの蛍光像から観察に適した部位を同定した。

肌动蛋白和微管等细胞骨架网络在形成神经元极性方面发挥着重要作用，神经元极性控制大脑中的信息处理功能。然而，现有的光学显微实验系统很难观察细胞内极性的形成过程，并且在阐明其分子机制方面进展甚微。因此，在本研究中，我们将利用结合光遗传学和冷冻电子断层扫描（Cryo-ET）的延时冷冻电子断层扫描（Cryo-ET）来捕捉细胞骨架网络的微小形态变化过程，并研究极性形成的机制。和疾病发生的目的是找出原因。为了利用冷冻电子断层扫描阐明细胞骨架网络的超微结构，必须仔细考虑网格上的细胞接种密度、粘附条件以及网格浸入式冷冻装置的类型和设置。因此，今年，我们首先使用野生型海马神经元研究这些条件，并获得了最佳条件。接下来，为了观察极性形成过程，除了F-肌动蛋白荧光标记Lifeact-EGFP之外，我们还将PA-Rac1（一种允许形成肌动蛋白纤维网络的光遗传学工具）引入海马神经元。然后，我们根据光照射时间定量分析网络的激活情况。利用获得的数据，我们使用浸入式冷冻装置Vitrobot以特定时间过程快速冷冻样品以激活Rac1，并成功获得了不同时间的样品。然后，他们使用冷冻荧光显微镜 Cryo EM CLEM 拍摄整个网格，该显微镜可以观察冷冻样品，并根据 PA-Rac1 表达和 Lifeact-EGFP 荧光图像确定适合观察的位点。