出芽酵母ミオシン分子の機能制御機構の解析

酿酒酵母肌球蛋白分子功能调控机制分析

• 批准号: 12030201
• 负责人: 鎌田 このみ
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12030201/
• 关键词: 出芽酵母; タイプIミオシン; アクチン; 温度感受性変異; 出芽酵母; タイプIミオシン; アクチン; 温度感受性変異

出芽酵母タイプIミオシン分子の機能制御機構を解明するために、本研究ではまず、タイプIミオシンのtail部分に変異を持つコンディショナルな機能欠損変異株を作製した。出芽酵母はタイプIミオシン分子をコードする2つの遺伝子MYO3,MYO5を有し、両者を共に破壊した株は著しい増殖遅延を示す。変異誘発PCR法によりtail部分にランダムに変異を導入したMYO5^*を組み込んだプラスミドを用いて、myo3myo5二重変異株を形質転換し、30℃での増殖は回復するが、37℃では増殖不能あるいは著しい遅延を起こす株を探索した。その結果6種類の温度感受性変異株を得ることに成功した。これら6種の変異株は全てアクチンの局在が異常になっていた。また、これらの変異株において、変異タンパク質の高温での安定性を検討した。その結果、低温では野生型と差異が認められないが高温では非常に不安定となるもの(Myo5-218p)、逆に温度に関わらず野生型よりもむしろ安定に存在するもの(Myo5-360p)が存在した。変異タンパク質がより安定に存在するMyo5-360pについてはGFPとの融合タンパク質を作製し、細胞内局在を調べたところ、正しく局在できなくなっていた。次に、高温で変異タンパク質が不安定になるmyo5-218を用いて、新たな変異により高温での増殖を回復する復帰変異株を分離した。分離した変異は優性の変異であり、原因遺伝子を同定したところ、膜貫通領域と、C2領域と呼ばれる種々のタンパク質に広く存在が知られている領域を持ったYML072cであることがわかった。Yml072cpに特定の1アミノ酸変化が生ずることによって、タイプIミオシンの機能欠損により起こる増殖障害を克服する事ができると考えられる。今後、さらにこの遺伝子産物の細胞内での役割を解明することにより、タイプIミオシンの生理機能を明らかにできる。

为了阐明发芽酵母I型肌球蛋白分子的功能调节机制，在这项研究中，我们首先创建了一个有条件的，功能不足的突变菌株，并在I型肌球蛋白型的尾部突变。酵母酵母具有两个基因MyO3和Myo5编码I型肌球蛋白分子，并且破坏这两者的菌株均表现出显着的生长延迟。使用将Myo5^*与诱变PCR引入尾部部分中的肌无力突变的质粒，将Myo3MyO5双重突变体转换为肌无力，并在30°C下恢复但无法在37°C下恢复或导致显着延迟。结果，成功获得了六个不同温度敏感的突变体。所有六个突变体的肌动蛋白均异常定位。此外，在这些突变菌株中研究了突变蛋白在高温下的稳定性。结果，在低温下与野生型没有差异，但是在高温下（MyO5-218p）非常不稳定，相反，有些比野生型（MyO5-360p）更稳定，无论温度如何。对于Myo5-360p，静坐蛋白更稳定，产生了带有GFP的融合蛋白并检查了亚细胞定位，并且无法正确定位。接下来，Myo5-218在高温下使静坐蛋白不稳定的Myo5-218用于隔离可逆突变体，该突变体通过新突变在高温下恢复生长。分离的突变是一个显性突变，当鉴定出致病基因时，发现它是YML072C，它具有跨膜区域，并且在各种称为C2区域的蛋白质中广为人知。据信，YML072CP中的特定一种氨基酸变化可以克服由I型肌球蛋白的功能缺乏引起的增生性疾病。将来，我们可以通过阐明该基因产物的细胞内作用来进一步阐明I型肌球蛋白的生理功能。