肝細胞癌におけるEB1とOATP1B3の分子病理学的関連性の解明

阐明EB1与OATP1B3在肝细胞癌中的分子病理关系

• 批准号: 22K16476
• 负责人: 相山 健
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16476/
• 关键词: 免疫染色; ノックアウト細胞株; 肝細胞癌; EB1; OATP1B3

臨床検体を用いた免疫染色(免染)は、ようやく倫理委員会の許可がおりたところである。現在数例の検体を用いてEB1とOATP1B3の免染の条件検討を行っている。免染のポジティブおよびネガティブコントロールとして細胞株のセルブロックを作製し条件検討に使用している。細胞実験については、現在保有している肝癌細胞株(PLC/PRF/5、HLE、HLF、HuH-7、JHH4、KIM-1、KYN-2、Li-7)のCt-OATP1B3(Cancer-type OATP1B3)のmRNAの発現量を確認した。対照としてはCt-OATP1B3の発現が報告されている結腸癌細胞株であるHCT-116を用いた。また、先行研究で作成したHuH-7のEB1-KO(Knock Out)株とこれらにLentivirus vectorを用いてEB1を過剰発現させた細胞株と対照としてEmpty Lentivirus vectorを使用した株をそれぞれ用いて、同様にCt-OATP1B3のmRNA発現量を解析した。大部分の肝癌細胞株でCt-OATP1B3の発現が認められ、KYN-2は特に高発現であった。HuH-7のEB1KO株、EB1Overexpression株の検討ではHuH-7でのCt-OATP1B3発現量と比較し、EB1KO株では発現量の減少を認め、逆にEB1Overexpression株では発現量の増加を認めた。また、上記肝癌細胞株のOATP1B3のタンパクの発現量も確認した。 これらの結果からOATP1B3の発現量が比較的高い肝癌細胞株を選択し、CRISPR-Cas9によるOATP1B3-KO株を現在作製中である。しかし、OATP1B3が増殖能の関わっている影響なのか、KO用のCRISPR-Cas9を導入した細胞株の生存率が悪く、作製に難渋している。

使用临床标本进行免疫染色最终得到了伦理委员会的批准。我们目前正在研究使用多个样本进行 EB1 和 OATP1B3 免疫染色的条件。作为免疫染色的阳性和阴性对照，制备细胞系的细胞块并用于测试条件。关于细胞实验，我们将使用Ct-OATP1B3（癌症型OATP1B3）mRNA的表达水平进行确认。使用 HCT-116（据报道表达 Ct-OATP1B3 的结肠癌细胞系）作为对照。此外，我们还使用了之前研究中创建的HuH-7 EB1-KO（Knock Out）菌株，即使用慢病毒载体过表达EB1的细胞系，以及使用空慢病毒载体的菌株作为对照。分析Ct-OATP1B3的mRNA表达水平。在大多数肝癌细胞系中均观察到 Ct-OATP1B3 表达，其中 KYN-2 表达尤其高。在检测HuH-7的EB1KO菌株和EB1过表达菌株时，我们比较了HuH-7中Ct-OATP1B3的表达水平，发现EB1KO菌株中的表达水平降低，相反，HuH-7中的表达水平升高。 EB1过表达菌株。此外，还证实了上述肝癌细胞系中OATP1B3蛋白的表达水平。 基于这些结果，我们选择了OATP1B3表达水平相对较高的肝癌细胞系，目前正在使用CRISPR-Cas9创建OATP1B3-KO细胞系。然而，或许是由于OATP1B3对增殖能力的影响，导入CRISPR-Cas9进行KO的细胞系存活率较差，创建困难。