Optical analysis of synaptic vesicle exocytosis by fluorescence GABA imaging with single synapse resolution

单突触分辨率荧光 GABA 成像对突触小泡胞吐作用的光学分析

• 批准号: 21K15196
• 负责人: 瀧川 健司
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital and Institute of Gerontology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K15196/
• 关键词: GABA; 蛍光プローブ; シナプス; イメージング

当該年度では、単一シナプスレベルでのGABA蛍光イメージングを可能にする高性能なハイブリッド型のGABA蛍光プローブの開発に取り組んだ。高性能なハイブリッド型のGABA蛍光プローブの開発は、GABA結合タンパク質上に標識する蛍光色素の最適な位置を探索することで行った。その際、網羅的に探索する場合と比べて、GABA結合タンパク質の立体構造情報をもとに探索する標識位置の数を10分の1程度に絞り込むことで、最適な標識位置の探索を効率化した。GABA結合タンパク質には、先行研究からGABAに結合することが報告されている細菌由来のタンパク質を採用した。また、蛍光色素には、外界の環境に応じて蛍光のON/OFFが切り替わる環境感受性蛍光色素を採用した。これらを材料に、システイン点変異を導入した組換えタンパク質を大腸菌発現系にて取得し、チオール基と特異的に反応する環境感受性蛍光色素を標識することでGABA蛍光プローブ候補を作製した。蛍光プローブ候補を効率的に作製するために、昨年度にGABA蛍光プローブのスクリーニングに最適化したHyFInDスクリーニングシステムを用いて、36種類のシステインの点変異体と、2種類の蛍光色素との組み合せからなる72種類の蛍光複合体を作製した。単一シナプスレベルでのGABA蛍光イメージングを実現する上で蛍光強度変化の大きい蛍光プローブが望ましいため、GABA添加によって惹起される蛍光強度変化を指標にスクリーニングを行った。その結果、GABAに応答して蛍光強度が2倍以上変化する高性能な新規GABA蛍光プローブを10種類取得することに成功した。

今年，我们致力于开发高性能混合 GABA 荧光探针，能够在单突触水平上进行 GABA 荧光成像。我们通过寻找荧光染料标记 GABA 结合蛋白的最佳位置，开发了一种高性能混合 GABA 荧光探针。此时，与穷举搜索相比，基于GABA结合蛋白的三维结构信息，待搜索的标签位置数量缩小至十分之一左右，使得对最佳标签位置的搜索更加容易。有效。作为 GABA 结合蛋白，我们使用了一种细菌蛋白，该蛋白在之前的研究中已被报道可与 GABA 结合。此外，我们还采用了环境敏感型荧光染料，可根据外部环境开启和关闭荧光。以这些为材料，我们在大肠杆菌表达系统中获得了带有半胱氨酸点突变的重组蛋白，并通过用与硫醇基团特异性反应的环境敏感荧光染料对其进行标记，创建了 GABA 荧光探针候选物。为了高效地生产荧光探针候选物，我们使用去年针对筛选 GABA 荧光探针进行了优化的 HyFInD 筛选系统，创建了 36 种半胱氨酸点突变体和 2 种荧光染料的组合，我们创建了 72 种荧光探针。荧光配合物的类型。由于需要荧光强度变化较大的荧光探针来实现单突触水平的GABA荧光成像，因此我们以GABA的添加引起的荧光强度变化作为指标进行筛选。结果，我们成功获得了10种新型高性能GABA荧光探针，其荧光强度响应GABA而变化超过两倍。