多階層イメージングを可能にする新規蛍光プローブ群の開発

开发可实现多级成像的新型荧光探针组

• 批准号: 19J15405
• 负责人: 小尾 紀翔
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Gunma University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-25 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J15405/
• 关键词: AS-PaRac1; 機能的コネクトミクス; シナプス・アンサンブル; シナプス光遺伝学; シナプス; 2光子励起

神経細胞のつながりであるシナプスを経時的に同一個体で観察することが出来れば、学習や記憶、そして疾患発症の前後における神経回路改変を捉える“機能的”コネクトミクスが達成出来ると考えられた。そのため、新生・増大した樹状突起スパインを標識し、光操作することが可能な新規光プローブAS-PaRac1(Activated Synapse Targeting Photoactivatable Rac1)の性質を最大限利用し、学習に伴って増強するシナプス群であるシナプス・アンサンブルを大規模に可視化する技術を確立することを目指している。そして本プロジェクトの最大の障壁の一つが、シナプス前部をmTurquoise2 fused VAMP2、シナプス前部が投射する神経細胞をtdTomato、そしてシナプス後部（スパイン）をAS-PaRac1-mCloverの3色で多重標識した際に観察される3重標識punctaにおいて、シナプスが形成されているかどうか検証することである。これらのプローブを前頭前野と扁桃体にウイルスベクターで導入した場合、十分な数の3重標識punctaを得るために要するマウス数は非常に多くなることが予想された。そのため、この検証を効率的に進めるため、マウスSlice cultureに直接アデノ随伴ウイルスベクター (AAV)を感染させ、3重標識punctaをSlice culture上で観察することを計画し、実験条件の最適化を行った。その結果、Slice cultureに作製済みのAAVでプローブを発現させることに成功し、現在3重標識像におけるシナプス観察を行っている。シナプスの有無を判定するための方法として、3重標識像を有するpunctaをSucroseで刺激し、誘発されたシナプス前部からのvesicle releaseをPost neuronからのWhole-cell patch clamp recordingで検出することを計画している。

人们认为，如果随着时间的推移可以在同一个体中观察到突触（神经细胞之间的连接），那么就有可能实现“功能性”连接组学，从而捕获学习、记忆以及前后神经回路的变化疾病的发作。为此，我们将最大限度地发挥新光学探针 AS-PaRac1（激活突触靶向光激活 Rac1）的特性，它可以标记和光操纵新形成和扩大的树突棘，以及随着学习而增强的突触群。旨在建立大规模可视化突触整体的技术。这个项目的最大障碍之一是当我们用 mTurquoise2 融合 VAMP2 多重标记突触前、用 tdTomato 投射突触前的神经元以及用三种颜色：AS-PaRac1-mClover 标记突触后（脊柱）的目的。本研究旨在验证在 中观察到的三重标记斑点中是否形成突触。如果使用病毒载体将这些探针引入前额皮质和杏仁核，我们预计获得足够数量的三标记点所需的小鼠数量将显着增加。因此，为了有效地进行这一验证，我们计划用腺相关病毒载体（AAV）直接感染小鼠切片培养物并观察切片培养物上的三标记斑点，并优化实验条件。结果，我们成功地在切片培养制备的 AAV 中表达探针，目前正在三标记图像中观察突触。作为确定突触是否存在的方法，我们用蔗糖的三重标记图像刺激了泪点，并使用我计划的后神经元的全细胞膜片钳记录来检测突触前诱导的囊泡释放。

项目成果

Development of multi-scale functional mapping of synaptic ensemble in the psychiatric model

精神病学模型中突触整体多尺度功能映射的发展

• 发表时间: 2019
• 作者: K. Goto;A. Kawasaki;K. Matsuoka;J. Kasahara;A. Matsuo;D. Nakata;R. Yokoo;J. Kim;I. Funaki;M. Uchiumi;Kisho Obi-Nagata;Kisho Obi-Nagata
• 通讯作者: Kisho Obi-Nagata

Extra-large spines distort neuronal computation in synaptic disorders

超大棘扭曲突触疾病中的神经元计算

• 发表时间: 2021
• 作者: K. Goto;A. Kawasaki;K. Matsuoka;J. Kasahara;A. Matsuo;D. Nakata;R. Yokoo;J. Kim;I. Funaki;M. Uchiumi;Kisho Obi-Nagata
• 通讯作者: Kisho Obi-Nagata

Development of innovative wide-view mapping of synaptic ensemble in the psychiatric model

精神病学模型中突触整体的创新宽视角映射的开发

• 发表时间: 2019
• 作者: K. Goto;A. Kawasaki;K. Matsuoka;J. Kasahara;A. Matsuo;D. Nakata;R. Yokoo;J. Kim;I. Funaki;M. Uchiumi;Kisho Obi-Nagata;Kisho Obi-Nagata;Kisho Obi-Nagata;Kisho Obi-Nagata;Kisho Obi-Nagata
• 通讯作者: Kisho Obi-Nagata