シナプス前終末の超高速分泌と分泌細胞の緩徐分泌の分子・原子基盤の研究

突触前末梢超快分泌和分泌细胞慢速分泌的分子和原子基础研究

• 批准号: 19J10613
• 负责人: 守本 祐一
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-25 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J10613/
• 关键词: シナプス小胞; シナプス前終末; 機械刺激; STED顕微鏡; FRET; FLIM; SNAP25; 蛍光プローブ; 開口放出

前年度までに、シナプス前終末におけるSNAP25のdomain swapping構造は、シナプス前終末に対するガラスピペットでの機械刺激でも起こせることが示唆された。これは、機械刺激によってシナプス小胞と活性帯との結合が促進されるためと考えられる。本年度は機械刺激後にSNAP25がdomain swapping構造をとるまでの時間を計測する系を整備した。具体的には、電動マニピュレータを用いてシナプス前終末を時間解像よく機械刺激することに成功した。また、SwappingをモニターするためのFRET/FLIM蛍光プローブの蛍光寿命測定を、これまでの2光子顕微鏡から1光子顕微鏡に切り替え、高速化を可能にし、時間解像を大幅に向上させることができた。超解像STED顕微鏡を用いたシナプス小胞の状態の観察に関しては、シナプス小胞に局在するタンパク質をこの顕微鏡に適する色素で標識して観察した。その結果、通常の光学顕微鏡では観察困難であった微細構造を観察することができた。超解像STED顕微鏡では生体標本を観察することができるため、この微細構造の時間経過の中での動態を解析することができた。また、シナプス小胞の活性帯への結合を高解像度で確認するための超解像STED顕微鏡用のFRET蛍光プローブも作成した。観察の結果、シナプス小胞と活性帯の結合部位をこれまでの光学顕微鏡法よりも高い精度で同定できるようになった。この結合部位の時間変化も観察できた。しかし、超解像STED顕微鏡で用いられる高強度のレーザーによる退色が観測の妨げとなるため、今後は退色に耐性のある蛍光色素を選定するなどの改良を加える。

去年，有人提出可以通过用玻璃移液管对突触前末梢进行机械刺激来诱导突触前末梢中SNAP25的域交换结构。这被认为是因为机械刺激促进了突触小泡和活性区之间的连接。今年，我们开发了一个系统来测量 SNAP25 在机械刺激后呈现域交换结构所需的时间。具体来说，我们成功地使用电动操纵器以良好的时间分辨率机械刺激突触前末梢。此外，用于监测交换的FRET/FLIM荧光探针的荧光寿命测量从传统的双光子显微镜切换为单光子显微镜，从而可以加快测量速度并显着提高时间分辨率。关于使用超分辨率STED显微镜观察突触小泡的状态，用适合该显微镜的染料标记突触小泡中局部的蛋白质并进行观察。结果，我们能够观察到使用普通光学显微镜难以观察到的微观结构。由于可以使用超分辨率 STED 显微镜观察生物样本，因此我们能够分析这种微观结构随时间的动态变化。我们还创建了用于超分辨率 STED 显微镜的 FRET 荧光探针，以确认突触小泡在高分辨率下与活性区的结合。观察结果表明，与以前的光学显微镜方法相比，能够以更高的精度识别突触小泡和活性区之间的结合位点。还观察到该结合位点随时间的变化。然而，超分辨率STED显微镜使用的高强度激光导致的褪色阻碍了观察，因此未来将进行改进，例如选择抗褪色的荧光染料。