微生物の全ゲノム解析を実現する「DNA非切断型」Target-AID技術の拡張

扩展“非 DNA 切割”Target-AID 技术，实现微生物的全基因组分析

基本信息

批准号：
19J40073
负责人：
坂野聡美
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J40073/
关键词：
ゲノム編集合成生物学 CRISPR 遺伝子工学大腸菌

项目摘要

本研究は、DNA を切らずにゲノム編集を行うTarget-AID 技術を、次世代の合成生物学、遺伝子工学を飛躍的に発展させる基盤技術として確立することを目的とする。具体的には、塩基置換融合酵素dCas9-PmCDA1 と配列認識モジュールCRISPR-gRNA を原核生物に導入するだけで、複数の標的DNA の同時編集を簡便かつ高確率に行うツールへと技術拡張し、応用・実用化に向けて研究を進めてきた。現在、大腸菌ゲノムの標的1遺伝子内に、ある程度効率よく変異を導入することが可能となっている。しかしながら、複数の標的DNA への同時塩基置換を、簡便化かつ高効率化することが課題である。そこで、本課題３年目では、まず、複数遺伝子への同時塩基置換の効率を上げるために、３～６種類の標的部位をもつCRISPR-gRNAプラスミドを同時に大腸菌に導入する際の培養条件検討と同時塩基置換の効率を調べた。様々な方法を試した結果、３～４遺伝子への同時塩基置換を確認することができたが、その置換効率は配列に依存しており、まったく置換されない配列というのもあった。今後は、プラスミドに頼らない遺伝子編集法の構築を検討する必要がある。次に、技術の拡張に向けて、標的1遺伝子変異導入を用いた、薬剤耐性菌の変異個所探索法の培養条件検討を行った。培養時の薬剤添加とゲノム編集を行うタイミングを試行錯誤した結果、薬剤耐性に関わる既知の遺伝子以外の配列がいくつか同定された。現在その配列情報に関しては解析中である。今後は、培養条件の再検討やスクリーニング法の改良などを行い、Target-AIDを用いた新規遺伝子スクリーニング法の構築を行う予定である。

这项研究的目的是建立Target-AID技术，该技术无需切割DNA即可进行基因组编辑，作为将极大推进下一代合成生物学和基因工程的基础技术。具体来说，通过简单地将碱基取代融合酶 dCas9-PmCDA1 和序列识别模块 CRISPR-gRNA 引入原核生物，我们将将该技术扩展为一种可以轻松且高概率地同时编辑多个目标 DNA 的工具。正在向实际应用迈进。目前，可以以一定的效率将突变引入大肠杆菌基因组中的单个靶基因。然而，挑战在于简化并提高同时碱基替换到多个目标 DNA 中的效率。因此，在这个项目的第三年，我们将首先检查将具有三到六种靶位点的CRISPR-gRNA质粒同时导入大肠杆菌时的培养条件，以提高同时碱基替换的效率研究了同时碱基替换的效率。经过尝试各种方法，我们能够确认三到四个基因同时发生碱基替换，但是替换的效率取决于序列，并且有一些序列根本没有被替换。未来有必要考虑构建不依赖质粒的基因编辑方法。接下来，为了扩展该技术，我们检查了使用定向单基因诱变寻找耐药细菌突变位点的方法的培养条件。通过在培养和基因组编辑过程中对药物添加时间进行反复试验，确定了除已知基因外参与耐药性的几个序列。目前正在分析序列信息。未来，我们计划重新审视培养条件并改进筛选方法，并利用Target-AID构建新的遗传筛选方法。