体の左右差を生み出す仕組みの進化

身体左右差异机制的进化

基本信息

批准号：
19J20629
负责人：
鈴木智佳
金额：
$ 1.6万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J20629/
关键词：
左右軸形成繊毛ウニ棘皮動物左右非対称性 Nodal

项目摘要

昨年度までの実験で、原腸繊毛が何かしらの形で正確な左右軸形成に関与していそうであることは結論づけられた。しかし、原腸の繊毛がどのような過程で形成され、どのように機能的な動きを見せるようになるのか等の基本的な情報が欠落していることが、正確な解釈への障壁となっていることに気づいた。そこで、今年度は、原腸繊毛が形成される位置や繊毛の配向が原腸陥入に伴ってどのように変化するのかを明らかにしようと、原腸細胞と原腸繊毛のより詳細な観察に取り組んだ。まず、「繊毛をGFPで光らせるコンストラクト」を発現させた胚を固定し、免疫蛍光染色法と共焦点レーザー顕微鏡による高解像度の観察法を用いて、GFPと繊毛の根元に存在するgamma-tubulinを検出する方法を試した。しかし、数多くのウニを用いて、様々な条件下で観察を試みたにも関わらず、「繊毛をGFPで光らせるコンストラクト」を発現させると多くの胚は死んでしまう上に、原腸繊毛にGFPタグが取り込まれない場合も多かった。そのうえ、今回利用したanti-gamma-tubulin抗体は外胚葉の細胞膜をぼんやりと染めてしまうので、外胚葉の染まりがバックグラウンドシグナルとなり、胚の中央に位置する原腸でgamma-tubulinシグナルを観察する妨げとなった。そこで次に、マイクロインジェクションに用いる細い針を用いて原腸胚を生きたまま前後軸に沿って背側と腹側に切り分けて、内胚葉にアクセスしやすくしたうえで同様の観察を試みた。しかし、こちらも数多くのチャレンジにも関わらず、切り分ける過程で原腸細胞の形が損なわれてしまい、正確な観察をすることが出来なかった。現在は、zebrafishやxenopusで繊毛の根元だけを標識することが確認されているmRNAをウニ胚にマイクロインジェクションすることで、この課題を解決しようと試みている。

直到去年进行的实验得出的结论是，原肠胚纤毛可能以某种方式参与形成正确的左右轴。然而，我注意到，缺乏基本信息，例如原肠胚中的纤毛如何形成以及它们如何表现出功能性运动，是准确解释的障碍。因此，今年，我们将对原肠胚细胞和原肠胚纤毛进行更详细的观察，以阐明原肠胚纤毛的形成位置以及纤毛方向如何随着原肠胚形成而变化。首先，我们固定了表达使纤毛发出 GFP 发光的构建体的胚胎，并使用免疫荧光染色和使用共聚焦激光显微镜的高分辨率观察来检测 GFP 和 γ-微管蛋白，这是我尝试的检测方法。。然而，尽管尝试在各种条件下使用大量海胆进行观察，但当“使纤毛发出 GFP 发光的构建体”表达时，许多胚胎死亡，并且 GFP 并未出现在许多原肠胚纤毛中。情况下，标签未导入。此外，本次使用的抗γ微管蛋白抗体对外胚层的细胞膜的染色模糊，因此外胚层的染色成为背景信号，并且在位于胚胎中心的原肠胚中观察到γ微管蛋白信号。这是一个障碍。接下来，他们使用细的显微注射针将活原肠胚沿前后轴切成背侧和腹侧部分，使其更容易进入内胚层，然后尝试类似的观察。然而，尽管面临诸多挑战，原肠胚细胞的形状在切割过程中被破坏，使得精确观察变得不可能。我们目前正试图通过将 mRNA 显微注射到海胆胚胎中来解决这个问题，该胚胎已被证实仅标记斑马鱼和爪蟾的纤毛基部。