Structural analysis of polyketide synthase using cross-linking reaction

利用交联反应进行聚酮合酶的结构分析

基本信息

批准号：
20H02911
负责人：
宮永顕正
金额：
$ 11.56万
依托单位：
The University of Tokyo (2023)Tokyo Institute of Technology (2020-2022)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

モジュラー型ポリケタイド合成酵素 (PKS) はポリケタイド化合物の基本骨格構築を担う酵素である。その反応においては、アシル基を結合したキャリアータンパク質 (CP) がモジュール内に存在する各触媒ドメインに順番に運ばれ、一連の反応を受ける。各触媒ドメインはCPを認識して結合していると考えられ、その相互作用の詳細に興味が持たれる。本年度は、昨年度に引き続き、抗生物質FD-891の生合成に関わるPKS GfsAのローディングモジュールの構造機能解析を検討した。GfsAのローディングモジュールは、KS様脱炭酸酵素 (KSQ) ドメインとアシル基転移酵素 (AT) ドメインとCPドメインの3つのドメインから構成される。KSQドメインにCPドメインが結合したGfsA CP=KSQ-ATクロスリンク複合体の結晶構造解析を進めた。その結果、分解能3.4 Åでの構造を決定することに成功し、KSQとCPの間の相互作用様式を明らかにすることができた。決定した構造は、脱炭酸過程におけるPKSローディングモジュール全体構造に相当することから、意義深い結果であるといえる。より高分解能の構造を決定すべく、GfsA CP=KSQ-ATクロスリンク複合体の結晶構造解析を継続して進めている。クライオ電子顕微鏡データも収集しており、現在、解析を行っている。また、今年度は、クレミマイシン生合成に関わるPKSに含まれる脱水酵素 (DH) ドメインとCPのクロスリンク反応を新たに検討した。パンテテインアミドプローブを用いてCPドメインを修飾したのちにDHドメインを混合したところ、これらのクロスリンク複合体が特異的に得られることがわかった。現在、得られた複合体を精製し、結晶化の検討を行っている。

模块化聚酮合酶（PKS）是一种负责构建聚酮化合物基本骨架的酶。在反应中，带有酰基的载体蛋白（CP）被顺序递送到模块内的每个催化结构域并经历一系列反应。每个催化结构域被认为能够识别并结合 CP，并且这种相互作用的细节令人感兴趣。今年，继去年之后，我们对PKS GfsA的装载模块进行了结构和功能分析，该模块参与了抗生素FD-891的生物合成。 GfsA 的加载模块由三个结构域组成：KS 样脱羧酶 (KSQ) 结构域、酰基转移酶 (AT) 结构域和 CP 结构域。我们对 GfsA CP=KSQ-AT 交联复合物进行了晶体结构分析，其中 CP 结构域与 KSQ 结构域结合。结果，我们成功地以3.4 Å的分辨率确定了结构，并能够阐明KSQ和CP之间的相互作用模式。确定的结构对应于脱羧过程中PKS加载模块的整个结构，因此该结果具有重要意义。为了以更高分辨率确定结构，我们正在继续分析GfsA CP=KSQ-AT交联复合物的晶体结构。冷冻电子显微镜数据也已收集，目前正在分析。此外，今年，我们新研究了参与cremimycin生物合成的PKS中包含的脱水酶（DH）结构域与CP之间的交联反应。当使用泛酰酰胺探针修饰CP结构域，然后与DH结构域混合时，发现这些交联复合物是特异性获得的。目前，我们正在纯化获得的复合物并研究其结晶。