オートファジー抑制因子Rubiconとその阻害剤の機能発現機構の解明

阐明自噬抑制因子 Rubicon 及其抑制剂的功能表达机制

基本信息

批准号：
20K05839
负责人：
上西達也
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度は、Rubiconのドメイン欠損変異体をヒト培養細胞に一過性に発現させ、その破砕液を化合物が架橋されたセファロースビーズと混合することで、化合物との相互作用にはRubiconのC末端側の一部の領域が重要であるという示唆を得た。そこで今年度はその再現を試みたものの、遊離の化合物の存在下でこの相互作用が競合的に阻害されず、むしろビーズと共沈するRubiconの量が増加したことから、Rubiconはビーズに架橋された化合物と相互作用していたというよりも、変性して沈殿していた可能性が高まった。なお、当初のスクリーニングにおいても両者の直接の結合の検出は行われていなかったため、新たに理研の長田研究室および東大の濡木研究室との共同研究で、Rubicon発現細胞の破砕液ではなく高度に精製されたRubiconを用いて、直接的な結合能を有する化合物のスクリーニングを開始している。一方、既報通りに実際にRubiconとの相互作用が確認できた14-3-3タンパク質およびNEMO以外にも、インタラクトーム解析から得られた複数の候補因子について共免疫沈降法によりRubiconとの相互作用の有無を引き続き調べた。リボソームタンパク質であるRPS17およびRPS27LはRubiconとは共沈しなかった。一方、昨年度に見出していた新規相互作用因子であるCa2+結合膜タンパク質との共沈に必要なRubiconのドメインを探索したところ、C末端の比較的広い領域が必須であることが判明した。さらにCa2+結合膜タンパク質についても同様に絞り込みを行ったところ、細胞質領域のC末端ドメインがRubiconとの相互作用に重要であることが示唆された。また、蛍光顕微鏡や近接ライゲーションアッセイにより、両者が細胞内で共局在することも確認している。

去年，Rubicon的突变体在人培养的细胞中瞬时表达，并将崩解溶液与复合的交联链混合在一起，提出建议Rubicon C末端的某些区域对于与该化合物的相互作用很重要。尽管我们试图在今年复制，但这种相互作用并未在自由化合物的存在下进行竞争性抑制，而与珠子相互沉淀的rubicon量增加，这增加了Rubicon已被修改和沉淀而不是与珠连链接化合物相互作用的可能性。此外，由于在初始筛选中未检测到两者之间的直接结合，并与瑞肯（Riken）的长田实验室和东京大学的诺基实验室合作，因此使用高度纯化的rubicon而不是中断的rubicon筛选了具有直接结合能力的化合物。另一方面，除了14-3-3蛋白和NEMO外，实际上已确认它们与前报道的Rubicon相互作用，我们继续研究是否通过从Interactome分析中获得的多个候选因素与Rubicon相互作用。核糖体蛋白RPS17和RPS27L未与Rubicon共沉淀。另一方面，当我们搜索与Ca2+结合膜蛋白共沉淀所需的Rubicon结构域时，这是我们去年发现的一种新型相互作用因子时，我们发现C-terminus处的相对较大的区域至关重要。此外，类似地缩小Ca2+结合膜蛋白表明，细胞质区域的C末端结构域对于与Rubicon的相互作用很重要。另外，荧光显微镜和接近连接分析证实，两者都在细胞内进行了共定位。