血液脳関門の細胞間隙透過性亢進時における脳内微小環境のイメージング

血脑屏障细胞间通透性增加期间大脑微环境的成像

• 批准号: 19K16350
• 负责人: 橋本 洋佑
• 金额: $ 2.5万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K16350/
• 关键词: Claudin-5; Blood-brain barrier; Tight junction; 血液脳関門

本研究は、血液脳関門の透過性が亢進した際に生じる脳内の本質的理解を目的としている。その手段として、密着結合の構成本体であるclaudin-5に対するshRNA発現アデノ随伴ウイルスを脳内各所に投与した後の投与部位周辺の脳内細胞の遺伝子発現の変動を、ダイセクターを用いてヒートマップ形式で評価していくことを企画していた。現在は、欧州の大学に留学している関係もあり、動物実験の実施許可を申し込み、必要なトレーニングを受けているが、修了するまで1年近い期間を要する。その間、in vivoでの実験の際にPCRを実施する遺伝子群の絞り込みをすることを目的に、in vitroの実験系によりclaudin-5の発現量を制御する遺伝子を網羅的に検出することを企画している。具体的には、Cas9/CRISPRシステムを用いてclaudin-5を発現している細胞の遺伝子をランダムに欠損させ、claudin-5の細胞表面量に基づいて細胞をフローサイトメトリーにより分離し、分離した細胞で発現しているguide RNAの配列情報からclaudin-5の発現量を正/負に制御している遺伝子群を同定していく。本系により実際に同定した遺伝子をノックダウンすることで、間接的にclaudin-5の発現を制御させることもできると期待される。本年度では、Sigma-Aldrich製のレンチウイルスによるgenome-wide screening kitの購入、同ウイルスを導入するためのブラストサイジン耐性を有するCas9/CRISPRを発現するマウス不死化血管内皮細胞株の作製、claudin-5の細胞外領域を認識する結合する分子の作製を行った。

这项研究的目的是了解当血脑屏障的通透性增加时大脑中发生的事情的本质。作为实现这一目标的一种手段，我们使用解剖器对注射部位周围脑细胞的基因表达变化进行热图绘制，这种病毒在向不同部位施用表达针对claudin-5（紧密连接的主要成分）的shRNA的腺相关病毒后。我打算根据格式来评估它。目前，他正在欧洲的一所大学留学，因此他已经申请了进行动物实验的许可，并正在接受必要的培训，但需要近一年的时间才能完成。同时，我们计划利用体外实验系统全面检测控制claudin-5表达水平的基因，目的是缩小基因组范围，以便在体内实验中进行PCR。具体来说，我们使用Cas9/CRISPR系统随机删除表达claudin-5的细胞中的基因，并根据细胞表面claudin-5的量通过流式细胞术分离细胞，我们将鉴定一组呈阳性/阴性的基因。从细胞中表达的指导RNA的序列信息控制claudin-5的表达水平。预计通过敲低使用该系统实际识别的基因，将有可能间接控制claudin-5的表达。今年，我们将从 Sigma-Aldrich 购买使用慢病毒的全基因组筛选试剂盒，创建表达具有杀稻瘟菌素抗性的 Cas9/CRISPR 的小鼠永生化血管内皮细胞系，以引入相同的病毒，并开发紧密蛋白 - 我们创建了一种结合分子识别5的细胞外区域。

项目成果

Potential for Tight Junction Protein?Directed Drug Development Using Claudin Binders and Angubindin-1

紧密连接蛋白的潜力？利用 Claudin Binders 和 Angubindin-1 进行药物开发

• DOI: 10.3390/ijms20164016
• 发表时间: 2019
• 影响因子: 5.6
• 作者: Hashimoto Yosuke;Tachibana Keisuke;Krug Susanne M.;Kunisawa Jun;Fromm Michael;Kondoh Masuo
• 通讯作者: Kondoh Masuo

Potential for Tight Junction Protein?Directed Drug Development Using Claudin Binders and Angubindin-1

紧密连接蛋白的潜力？使用 Claudin Binders 和 Angubindin-1 进行药物开发

• DOI: 10.3390/ijms20164016
• 发表时间: 2019
• 影响因子: 5.6
• 作者: Hashimoto Yosuke;Tachibana Keisuke;Krug Susanne M.;Kunisawa Jun;Fromm Michael;Kondoh Masuo
• 通讯作者: Kondoh Masuo

Development of drug delivery system for treatment of central nervous system diseases targeting tight junctions

开发针对紧密连接的治疗中枢神经系统疾病的药物递送系统

• DOI: 10.2745/dds.34.374
• 发表时间: 2019
• 作者: Hashimoto Yosuke;Kondoh Masuo;Takeda Hiroyuki
• 通讯作者: Takeda Hiroyuki