In-situ structural biology by NMR spectroscopy

通过核磁共振波谱进行原位结构生物学

• 批准号: 21H02419
• 负责人: 伊藤 隆
• 金额: $ 11.23万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H02419/
• 关键词: in-cell NMR; 蛋白質; 分子クラウディング; 立体構造; 相互作用; ダイナミクス; 液液相分離

細胞内の分子クラウディング環境は，蛋白質の生物活性のみならず，その立体構造やダイナミクスにも影響を与える．本研究ではin-cell NMRを用いて，細胞中蛋白質動態の詳細な理解を目指す．真核細胞内での，(1)蛋白質の立体構造・ダイナミクス，(2)マルチドメイン蛋白質のドメイン間相互作用，(3)蛋白質間相互作用，を解析するためには，in-cell NMR測定の様々な要素技術の高度化が必須である．In-cell NMRによって得られた立体構造，ダイナミクス，フォールディング安定性，蛋白質間相互作用を解析することで，細胞内分子クラウディング環境の普遍的な理解に挑戦する．2022年の研究業績は以下の通り．(1)細胞内蛋白質の立体構造・ダイナミクスの解析については，引き続き開発研究を進め，情報科学を駆使した自動NMRデータ解析で進展があった．GTP結合型RASの動的構造多形に対する細胞内環境の影響についても解析を開始した．また，植物培養細胞を用いたin-cell NMR解析も行った．(2)細胞内マルチドメイン蛋白質のドメイン間相互作用の解析については，常磁性NMR情報を効率よく利用したPCS/PRE情報からの蛋白質立体構造計算手法の開発を進めた．モデル試料としてヒトユビキチンタンデム２量体を用い，ランタノイド結合タグによって常磁性中心を導入した．その後，HeLa細胞に導入し解析を行った．現在細胞内環境における構造アンサンブルの決定を行っている．(3)細胞内蛋白質間相互作用の解析」ついては，クラウディング環境下で蛋白質間相互作用をとらえるための方法論的研究を継続して進めた．2021年から始めたGRB2とSOS1蛋白質の系に加えて，ショウジョウバエDrkとSosの相互作用の系も含めて解析を行い，それぞれの相互作用によって形成される液液相分離（LLPS）について解析を行った．

细胞内分子拥挤环境不仅影响蛋白质的生物活性，还影响其3D结构和动力学。在这项研究中，我们的目标是使用细胞内核磁共振来详细了解细胞中的蛋白质动力学。细胞内 NMR 测量对于分析 (1) 蛋白质 3D 结构和动力学、(2) 多域蛋白质的域间相互作用以及 (3) 真核细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用至关重要，这对于提高复杂性至关重要。各种基本技术。通过分析细胞内 NMR 获得的 3D 结构、动力学、折叠稳定性和蛋白质-蛋白质相互作用，我们的目标是获得对细胞内分子拥挤环境的普遍了解。 2022年研究成果如下。 （一）在细胞内蛋白质三维结构和动力学分析方面，持续推进研发，利用信息科学进行核磁共振数据自动分析取得进展。我们也开始分析细胞内环境对GTP结合RAS动态结构多态性的影响。我们还使用培养的植物细胞进行了细胞内核磁共振分析。 (2)关于细胞内多域蛋白的域间相互作用的分析，我们开发了一种根据PCS/PRE信息计算蛋白质3D结构的方法，该方法有效地利用顺磁NMR信息。我们使用人类泛素串联二聚体作为模型样本，并使用镧系元素结合标签引入顺磁中心。随后，将其引入 HeLa 细胞并进行分析。我们目前正在确定细胞内环境中的结构整体。关于“(3)细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的分析”，我们继续进行方法学研究，以捕捉拥挤环境中的蛋白质-蛋白质相互作用。除了我们2021年开始的GRB2和SOS1蛋白质系统外，我们还将分析果蝇Drk和Sos相互作用系统，并分析每种相互作用形成的液-液相分离（LLPS）。

项目成果

Structural and biochemical insights into heterotetramer formation of oncogenic K-Ras4BG12V and Rgl2, a RalA/B activator

对致癌 K-Ras4BG12V 和 Rgl2（RalA/B 激活剂）异四聚体形成的结构和生化见解

• DOI: 10.1101/2022.10.10.511529
• 发表时间: 2023
• 作者: 02.Tariq; M.; Ikeya; T.; Togashi; N.; Fairall; L.; Bueno
• 通讯作者: Bueno

GMPPNP結合型K-RasG12VとRgl2RBDの相互作用解析

GMPPNP 结合的 K-RasG12V 和 Rgl2RBD 的相互作用分析

• 发表时间: 2022
• 作者: 富樫 直之;宮田 裕貴;亀井 駿;菅澤 はるか;美川 務;猪股 晃介;田仲 加代子;伊藤 隆;池谷 鉄兵
• 通讯作者: 池谷 鉄兵

Solution NMR approaches to 3D structure determination of proteins in living eukaryotic cells

溶液 NMR 方法测定活体真核细胞中蛋白质的 3D 结构

• 发表时间: 2021
• 作者: Yutaka Ito; Kohsuke Inomata; Teppei Ikeya
• 通讯作者: Teppei Ikeya

Insight into the C-terminal SH3 mediated binding of Drosophila Drk towards Sos and Dos

深入了解 C 端 SH3 介导的果蝇 Drk 与 Sos 和 Dos 的结合

• 发表时间: 2021
• 作者: Sayeesh. P. M.; Teppei Ikeya; Haruka Sugasawa; Riki Watanabe; Yutaka Ito
• 通讯作者: Yutaka Ito

High‐Efficient and Dosage‐Controllable Intracellular Cargo Delivery through Electrochemical Metal?Organic Hybrid Nanogates

通过电化学金属有机混合纳米门实现高效且剂量可控的细胞内货物输送

• DOI: 10.1002/smsc.202100069
• 发表时间: 2021
• 作者: Zhang Bowen;Zheng Dinuo;Yiming Shi;Oyama Kazuhiro;Ito Masahiro;Ikari Masaomi;Kigawa Takanori;Mikawa Tsutomu;Miyake Takeo
• 通讯作者: Miyake Takeo