神経血管ネットワークを有するヒトiPS細胞由来高次肝組織の生体内での再構築

利用神经血管网络体内重建人 iPS 细胞来源的高级肝组织

基本信息

批准号：
21H02991
负责人：
小池直人
金额：
$ 11.23万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H02991/
关键词：
高次肝組織神経微小血管 iPS細胞血管門脈域

项目摘要

胆管、血管、神経が伴走して走行する門脈域を構築させるために、2021年度同様、ヒトiPS細胞由来の肝前駆細胞(hiPS-HE)、血管内皮細胞(hiPS-EC)、間葉系幹細胞(hiPS-STM)からなる多数の微小肝芽を神経幹細胞(hiPS-NCC)を3次元培養して得られた神経線維の上に添加し共培養した。2022年度はhiPS-NCCの誘導法を改良したことにより、より安定した実験結果を出すことに成功した。また、十分に神経線維を構築させるために、肝芽を追加するまでのhiPS-NCC単独の培養時間を10日から20日に延長した。hiPS-NCCにはGFPをhiPS-ECにはKO(Kusabira orange)を導入して可視化できるようにし、共培養した肝芽を蛍光顕微鏡でタイムラプス観察を行った。その結果、肝芽の共培養開始後、1から7日にかけて神経突起が肝芽に向かって伸びる様子が観察された。共培養7日目では、肝芽内で構築された血管の周りに神経線維が伴走している様子が観察された。また、CK19の免疫染色を行い肝芽における胆管の観察したところ、肝芽から胆管様に伸びた突起の周りに神経がまとわりついているように観察された。この形態は正常肝の門脈域の形態に近いものと考えられた。また、微小肝芽と肝芽の間に胆管構造の繋がりも観察された。神経を加えない群とで肝芽内の血管、胆管構造を、画像解析ソフトウエアを用いて定量解析し比較検討した。その結果、神経を加えない群では血管の総長、分岐数は有意に低下していた。胆管様の突起数も有意に短かった。また、培養上清中のアルブミン、フィブリノーゲン量をELISAにて測定すると神経の共培養を行なっていない群では有意に少なかった。また、アンモニアクリアランスも有意に低かった。

为了构建一个门静脉区域，如2021年，胆管，血管和神经运行，大量由人IPS细胞衍生的肝脏祖细胞（HIPS-HE）组成的微肝脏芽，由血管内皮细胞（HIPS-EC）和息肉细胞（hips-Stmerver cortried coptmal fibers）添加到nips-nips fibers（hips-he）中，将其添加到杂质的干细胞（hips-hips）中。（HIPS-NCC）。在2022财年，我们能够通过改善髋纳入hips-NCC诱导方法来实现更稳定的实验结果。此外，为了充分构建神经纤维，仅将臀部-NCC的孵育时间从10天延长至20天，直到添加肝芽。将GFP引入了HIPS-NCC中，并将KO（Kusabira Orange）引入HIPS-EC中，以使其可视化，并在荧光显微镜下对共培养的肝芽进行了延时观察。结果，观察到神经突向肝芽共培养后的1天至7天延伸。在共同培养的第七天，观察到神经纤维在肝芽中构造的血管周围奔跑。此外，当对CK19进行免疫染色时，观察到肝芽中的胆管，观察到神经在突起周围紧贴，这些突起像肝芽一样伸展的胆管。这种形态被认为类似于正常肝的门静脉的形态。另外，在微肝芽和肝芽之间观察到胆管结构的联系。定量分析了肝芽内的血管和胆管结构，并使用没有神经的组中的图像分析软件进行了比较。结果，在没有神经的组中，总血管长度和分支数量显着减少。类似胆管的投影的数量也明显短。此外，当通过ELISA测量培养上清液中白蛋白和纤维蛋白原的量时，没有神经共同培养的组中它的较小。氨间隙也明显降低。