雄因子と共に配偶子膜融合を担う雌因子の同定と解析：重複受精分子メカニズムの解明

负责配子膜融合的雌性因素与雄性因素的鉴定和分析：阐明双受精的分子机制

基本信息

批准号：
21H02517
负责人：
井川智子
金额：
$ 11.07万
依托单位：
Chiba University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

R4年度では，配偶子膜融合因子であるGCS1と相互作用するタンパク質種のプロテオーム解析結果より，検出信頼度が高いタンパク質種の中から「雌性組織での発現が期待されるもの」，「推定膜貫通領域を有するもの（あるいは膜局在シグナル配列を有するもの）」を主な指標として，その後の生化学及び分子生物学的解析の対象となるタンパク質種を数種選抜した。これらのタンパク質種とGCS1との相互作用を再検証するために，生化学的評価を行った。生化学的評価ではin vitroタンパク質合成とpull-downアッセイを行った。その結果，3種のタンパク質種においてGCS1との相互作用が示唆された。また別に，ベンサミアナタバコでのタンパク質発現による相互作用評価を行うため，遺伝子導入用のベクターを構築して，解析のツールを整備したた。解析対象タンパク質種に関して局在解析を行うため，内在性プロモーターからCDSを含む領域をクローニングして，C末端側にGFP遺伝子を融合させた遺伝子発現コンストラクトを作製した。これらコンストラクトを導入したシロイヌナズナ遺伝子組換え体を得た。上記タンパク質種において，タンパク質種Aについては，雌性配偶子の原形質膜上の局在が確認された。機能解析を行うべく，ゲノム編集によって遺伝子Aの変異個体を作出した。しかし遺伝子変異と表現型の相関が安定せず，再検証の準備を進めた。また別のタンパク質種Bについては，CRISPR/Cas9によるゲノム編集を行い，遺伝子組換え体第1世代の種子が獲得できた。

在2014财年，将从具有高检测可靠性的蛋白质物种中选择了几种用于随后的生化和分子生物学分析的蛋白质物种，包括“具有雌性组织”的蛋白质和“具有跨膜跨膜区域的那些（或具有膜局部信号序列）“作为蛋白质分析的蛋白质分析相互作用的主要指示剂）“作为膜的局部信号序列）”。进行了生化评估，以重新验证这些蛋白质与GCS1之间的相互作用。生化评估包括体外蛋白质合成和下拉测定。结果表明，在三种蛋白质中与GCS1的相互作用。此外，为了评估本萨米亚烟草中蛋白质表达的相互作用，我们已经构建了用于基因转移的向量并开发了一个分析工具。为了对要分析的蛋白质物种进行定位分析，从内源性启动子克隆了一个包含CD的区域，以创建一种基因表达构建体，其中GFP基因与C末端融合在一起。获得了引入这些构建体的基因修饰形式。在上述蛋白质物种中，确认蛋白质物种在质膜上的雌配子的定位。进行功能分析，基因组的突变体是通过基因组编辑产生的。但是，基因突变与表型之间的相关性不稳定，并进行了重新检查的准备。另一种蛋白质B是使用CRISPR/CAS9编辑的基因组，并获得了第一代转基因生物的种子。