Mass identification and modification of pyrophosphate-dependent kinases based on their three-dimensional structures

基于焦磷酸依赖性激酶三维结构的质量鉴定和修饰

基本信息

批准号：
21H02413
负责人：
藤橋雅宏
金额：
$ 11.32万
依托单位：
Osaka Medical and Pharmaceutical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

kinase によるリン酸化反応は、代謝や環境変化への応答など種々の重要な生命活動に関わる。リン酸化反応は ATP をリン酸基供与体とする報告がほとんどであるが、私達はピロリン酸 (PPi) をリン酸基供与体とするリン酸化反応の機構を世界に先駆けて明らかにし、PPi 依存性の kinase (PPi-kinase) を ATP 依存性 kinase (ATP-kinase) と見分けうる指標を見いだした。本研究ではこの指標を手がかりに、データベースに眠る未同定の PPi-kinase を様々な生物から同定することをめざしている。また、遺伝子データベース中の kinase から PPi-kinase を効率的に見いだす方法の構築も目指している。2021 年度に実施予定であった研究は、新型コロナウイルスの蔓延による所属機関の活動制限により、2022 年度にかけて 2 年間にわたっておこなった。まず、タンパク質三次元構造データベース (PDB) に登録されている kinase の約 2500 個について、予備研究により見出している立体構造上の特徴を有するかを調査した。この結果、いくつかの酵素を PPi-kinase の候補とすることができた。並行して予備研究で PPi-kinase であることが判明している酵素について、大腸菌による大量発現と精製、結晶化とならびに X 線結晶構造解析を行い、PPi-kinase がどのように PPi を認識するのかの解析をすすめた。活性スクリーニングについては、分担研究者の愛媛大学高橋准教授により、無細胞系での酵素発現、タグに対応する抗体と磁気ビーズによる精製により、多検体を効率的に発現精製す系を構築した。この系で発現精製した酵素により、PPi-kinase の候補が実際に PPi-kinase 活性を持つことも確認できた。

由激酶引起的磷酸化反应参与了多种重要的生命活动，例如代谢和对环境变化的反应。尽管据报道，大多数磷酸化反应将ATP用作磷酸盐供体，但我们是世界上第一个阐明磷酸化反应的机制，其中磷酸化反应的机制是磷酸盐（PPI）作为磷酸盐供体，并且可以从PPI依赖性激酶（PPI-Kinase）与ATP依赖性（依赖PPI依赖性基因酶）建立一个指数。本研究以此指标为线索，旨在识别来自各种生物体数据库中的身份不明的PPIKIKASE。他们还旨在构建一种方法，以有效地从基因数据库中的激酶中找到PPI-kinass。由于新冠状病毒的扩散，计划于2021年进行的计划在2021年开始进行的研究是在两年内进行的。首先，我们研究了在蛋白质三维结构数据库（PDB）中注册的大约2500个激酶是否具有初步研究中的构象特征。结果，可以将几种酶视为PPI-Kinase的候选物。同时，我们在一项初步研究中进行了广泛的表达，纯化，结晶和X射线晶体学，这些酶被发现是PPI-Kinase，并对发现是PPI-Kinase的酶进行了分析。关于活动筛查，共享研究人员埃希姆大学高桥副教授构建了一个系统，该系统有效地表达和纯化了与标签和磁珠相对应的抗体，通过无细胞的酶表达和纯化来净化多个标本。该系统中表达和纯化的酶证实了候选PPI-Kinase实际上具有PPI-KINASE活性。