ピロリン酸依存性プロテインキナーゼの探索とその構造機能解析

焦磷酸依赖性蛋白激酶的寻找及其结构和功能分析

• 批准号: 22K14825
• 负责人: 永田 隆平
• 金额: $ 2.33万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K14825/
• 关键词: ピロリン酸; キナーゼ

タンパク質のリン酸化は、キナーゼがATPから基質タンパク質へとリン酸基を受け渡すことで起こる。この反応は、細胞内でのシグナル伝達などに関わる重要な生体反応の一つである。一方、糖代謝などではATPでなくピロリン酸（PPi）をリン酸基供与体に用いるキナーゼが見つかっている。そこで本研究では、申請者が考案した探索方法によってゲノム情報からPPi依存性プロテインキナーゼを見つけ出し、その機能や反応機構を明らかにすることを目指す。本年度は、申請者が見つけたPPi依存性プロテインキナーゼの候補遺伝子TmHKの機能解析と他候補のin silicoスクリーニングによる探索を行った。TmHKは自己リン酸化を行うヒスチジンキナーゼであることから、機能解析はTmHKのリン酸化状態を電気泳動法によって分析することで行った。リン酸基に特異的に結合する試薬Phos-tag（E. Kinoshita, et al., Proteomics, 2008）を電気泳動のゲルに加えることで、目的酵素のリン酸化状態と非リン酸化状態を分離することを試みた。酵素反応における温度・時間・基質濃度などの反応条件や、泳動時のPhos-tag濃度やアクリルアミド濃度を検討することで、リン酸化されたTmHKを検出することに成功した。しかし、TmHKはATP, ADP, PPiをリン酸基供与体に用いた場合、ATPがあるときだけリン酸化され、予想に反してATP依存性であることがわかった。次に、他の候補のin silicoスクリーニングによる探索を行った。ここではスクリプトを自作することで一部の作業を自動化でき、大規模なスクリーニングを可能にした。今後、ここで確立した方法を様々な生物種に適応することで、目的酵素を効率的に探したいと考えている。

蛋白质的LIN氧化是由激酶从ATP传递到底物蛋白的激酶引起的。该反应是与细胞内信号传递相关的重要生物反应之一。另一方面，在葡萄糖代谢中，已经发现了激酶，其中用于基于lympto的捐赠而不是ATP，其中瓜素酸（PPI）用于基于lympto。因此，在这项研究中，我们旨在通过申请人设计的搜索方法从基因组信息中找到依赖性PPI依赖性的蛋白酶，并阐明其功能和反应机制。今年，申请人在激酶TMHK的功能分析中搜索了申请人的PPI依赖性突起-TMHK的候选者和其他候选硅筛选中的申请人。由于TMHK是一种执行自氧化的组氨酸激酶，因此通过电子游泳方法分析TMHK的磷化状态来进行功能分析。通过添加Phos-Tag（例如Kinoshita等，蛋白质组学，2008年），该phos-Tag与磷酸基团特别结合，我尝试了磷化的氧化态和靶酶的非磷酸态。通过检查酶反应中的温度，时间和底物浓度等反应条件，在游泳过程中，它成功地检测了磷酸盐氧化的TMHK。但是，当将TMHK用于磷酸盐供体的ATP，ADP和PPI时，发现它仅在ATP时才被磷酸化，并且与ATP相关，这与预期相反。接下来，我们通过其他候选人在计算机筛选中搜索。在这里，可以通过制作脚本来自动化一些工作，从而实现大规模筛选。将来，我们希望通过调整此处确定的各种物种的方法来有效地找到目的酶。