Development of high-sensitivity detection technology for nucleic acid amplification using metal and metal chelator and verification of its practicality

金属及金属螯合剂核酸扩增高灵敏检测技术开发及实用性验证

基本信息

批准号：
21K07340
负责人：
外園栄作
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

現在、ウイルスや細菌の検出，また，癌やその他の疾患の潜在的なバイオマーカーとして生体内で循環するmiRNAなどの核酸に着目した検査が臨床において用いられおり、今後さらにその需要が高まると予想される。核酸を用いた検査には、目的とする遺伝子の増幅が不可欠であり、これまでにもいろいろな増幅技術が開発され実用化されてきた。一方，増幅の程度を検出する技術においては、その多くが蛍光を標識した高価なプローブを用いた検出法であることから、励起装置や蛍光を検出する特別な機器が必須となる。そこで、本研究では，核酸の増幅時に副二次的に生成されるピロリン酸に着目し、酵素を用いてこのピロリン酸を低価格で高感度に検出することで、特別な機器や分析環境条件を問わない、かつ、目視にて検出可能な、より簡便な核酸増幅量の検出技術と核酸定量の開発を試み、本法の技術応用の可能性について探索・検証を行うこととする。これまでにピロリン酸検出の基本的な反応系の構築を水溶液ベースに置いて確立するに至ったが、本年度は、実際に核酸増幅後の試料を用いて検討を試みたところ、水溶液ベースと比較して何らかの反応の阻害が起きていることが判明した。そこで、阻害物質の特定と回避策を検討した結果、これらを回避する方法を見出すに至った。今後は、構築した方法を用いて、既存の核酸増幅技術との検出に関する比較検討を行う予定である。具体的には、増幅時間（サイクル数）を既存の方法と比較することで、本法の検出技術の有用性を評価するとともに、臨床展開への可能性についても検証を行う予定である。

目前，检测病毒和细菌，以及作为癌症和其他疾病的潜在生物标志物，重点介绍了核酸（例如miRNA）的测试，这些测试将用于临床实践中，并且需求将增加未来。在使用核酸的测试中，预期的基因扩增是必不可少的，并且已经开发了各种扩增技术。另一方面，在检测放大程度的技术中，许多检测荧光的激发设备和特殊设备是必不可少的，因为其中许多是使用荧光的昂贵探针。因此，在这项研究中，特殊的设备和分析环境条件集中在核酸扩增时产生的次要酸上，并使用酶以低廉的价格检测这种焦油酸。在本法律中的应用，无论它是什么，并且都会形成更简化的核酸扩增量和可以在视觉上检测到的核酸特异性量。到目前为止，已经建立了基本的莱酸检测的基本反应系统，但与水溶液碱相比，今年我们实际上尝试考虑使用核酸扩增后的样品表明某些反应是抑制作用。因此，由于识别和避免抑制剂，我们找到了一种避免这种抑制剂的方法。将来，我们计划使用施工方法比较和检查现有的核酸扩增技术的检测。具体而言，通过将放大时间（周期数）与现有方法进行比较，将评估该法律检测技术的有用性，并将验证临床发育的可能性。