ZTTK症候群の知的障害発症機構解明を目指した核内蛋白質SONの機能解析

核蛋白SON的功能分析旨在阐明ZTTK综合征智力障碍的发病机制

基本信息

批准号：
20K16876
负责人：
上田昌史
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Aichi Medical University (2022)National Center of Neurology and Psychiatry (2020-2021)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の解析には、内在性Son(ZTTK症候群の原因遺伝子SONのマウスホモログ)遺伝子の発現を低下させたモデルを作製する必要がある。Crispr/Cas9を用いたゲノム編集技術によるモデルマウス樹立の実験が、今年度も引き続き実施困難であった。本年度は国内学会に参加して研究遂行に必要な情報を収集し、細胞モデル作製を計画し実験の準備を開始した。当初の計画を変更し、マウス由来の神経細胞における内在性Sonの発現をshRNAノックダウンベクター導入により発現低下させ、内在性Sonノックダウン細胞を作製し、代替モデルとすることにした。shRNAノックダウンベクターは作製した代替モデルを用いて、以後のSon標的遺伝子群の遺伝子発現解析を行い、研究遂行する方法を計画した。今後は1年間補助事業期間を延長し、延長期間内に以下の内容を計画している。1. in vitro系を用いた細胞モデルの作製実験：マウス由来神経細胞株にshRNAノックダウンベクターをリポフェクション法により遺伝子導入する。遺伝子導入細胞を試料とするが、導入効率が低い場合はFACS (fluorescence-activated cell sorting)でGFPを指標としてSonノックダウン神経細胞をソーティングし試料とする。2. 細胞モデルを用いた遺伝子発現変化の検証実験：1で得られた細胞を試料とし、定量PCRを実施する。この時、SON標的遺伝子群であり、かつ知的障害原因遺伝子またはシナプス形成関連の遺伝子群に着目しそれらの発現量を定量する。またノックダウン効率の異なる２種類のノックダウンベクターを使用し、ノックダウン効率の違いによるこれら遺伝子群の発現量変化の差の有無や、発現変化を受ける遺伝子の違いの有無を検証する。

为了进行本研究的分析，有必要创建一个模型，其中内源性 Son（SON 的小鼠同源物，ZTTK 综合征的基因）的表达降低。今年，利用 Crispr/Cas9 基因组编辑技术建立小鼠模型的实验仍然难以实施。今年，我们参加了国内的学术会议，收集了研究所需的信息，规划了细胞模型的制作，并开始了实验的准备。我们改变了原来的计划，决定通过引入shRNA敲低载体来创建内源性Son敲低细胞，并将其用作替代模型，从而减少小鼠源性神经细胞中内源性Son的表达。使用替代shRNA敲低载体模型，我们对Son靶基因进行了后续基因表达分析，并规划了开展研究的方法。未来，补贴项目期限将延长一年，延长期内计划开展以下内容。 1.使用体外系统的细胞模型创建实验：通过脂转染将shRNA敲低载体引入小鼠源性神经细胞系。使用转染的细胞作为样本，但如果转染效率较低，则使用FACS（荧光激活细胞分选）以GFP为指示剂分选Son敲低神经元，并将其作为样本。 2.利用细胞模型验证基因表达变化的实验：以1中获得的细胞为样本进行定量PCR。目前，我们重点关注作为 SON 目标基因并导致智力障碍或突触形成的基因，并量化其表达水平。此外，还将使用两种不同敲低效率的敲低载体来验证这些基因组是否因敲低效率的差异而导致表达水平存在差异，以及发生表达变化的基因是否存在差异。