GCase受容体の構造生物学ーリガンドの認識機構と結合シグナルの分子内伝達機構

GCase受体的结构生物学-配体识别机制和结合信号的分子内传递机制

基本信息

批准号：
21K06044
负责人：
児玉昌美
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Juntendo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

グアニル酸シクラーゼ（GCase）受容体は、細胞外にリガンド結合（LB）ドメインを、細胞内にGCaseドメインを持ち、2量体として機能する。私たちはこれまでに、血圧・体液バランスの維持に不可欠なGC-A受容体について、LBドメインと心房型ナトリウム利尿ペプチド（ANP）の複合体のX線結晶解析を行い、2量体LBドメインの中心にANP１分子が結合し、LBドメインを旋回させることを明らかにした。本研究は、旋回運動に主眼を置いてGCase受容体の①リガンドを認識する機構と②結合シグナルを膜内へ伝達し、GCaseを活性化する機構を明らかにすることを目的としている。これまでにGC-A受容体のLBドメイン・C末端欠損変異型ANP複合体の構造解析では、LBドメインの旋回角度に違いを見出したが、独自開発した、Blue-native PAGEを用いた「リガンド結合による受容体の二量体形成を直接観察可能な系」において、欠損変異型ANPは受容体に対する結合親和性も低下していることが明らかになっており、構造解析で見出した旋回角度の違いがGCase活性に与える影響を正しく評価するためには、GCase活性のキネティックス解析が不可欠であった。しかしGCase活性測定のためのcGMPの定量には、ELISAのように時間的、金銭的にコストの大きい手法を用いてきたことから、GC-A受容体の誘導発現細胞株にcGMPのバイオマーカーを構成的に発現させることによって、低コストでリアルタイムにかつ簡便にGC活性を比較できる系をおおむね確立した。

鸟苷酸环化酶 (GCase) 受体具有胞外配体结合 (LB) 结构域和胞内 GCase 结构域，并作为二聚体发挥作用。迄今为止，我们对维持血压和体液平衡至关重要的 GC-A 受体的 LB 结构域和心房钠尿肽 (ANP) 复合物进行了 X 射线晶体分析，发现二聚体 LB结果表明，ANP1分子与LB结构域的中心结合并旋转LB结构域。本研究的目的是阐明 GCase 受体的机制（1）识别配体，以及（2）将结合信号传递到膜中并激活 GCase，重点是旋转运动。在对GC-A受体的LB结构域/C端缺失的突变ANP复合物进行结构分析时，我们发现LB结构域的旋转角度存在差异。在使用 PAGE 的“允许直接观察由于配体结合而形成的受体二聚体形成的系统”中，已经发现有缺陷的突变体 ANP 也降低了与受体的结合亲和力，因此结构分析 GCase 活性的动力学分析至关重要为了正确评估GCase活性中发现的旋转角度差异对GCase活性的影响。然而，为了定量cGMP以测量GCase活性，已经使用了在时间和金钱上昂贵的ELISA等方法，通过组成型表达它，我们基本上建立了一个可以低成本且容易地比较GC活性的系统。实时。