アミロイド触媒型の原始酵素モデルに着想した人工酵素のデザインと応用

受淀粉样蛋白催化原始酶模型启发的人工酶的设计与应用

基本信息

批准号：
22H01873
负责人：
真壁幸樹
金额：
$ 8.9万
依托单位：
Yamagata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H01873/
关键词：
アミロイド触媒アミロイド蛋白質工学人工酵素 βシート

项目摘要

本研究では触媒活性のあるアミロイド（アミロイド触媒）の部分配列を我々がこれまで研究してきたペプチド会合模倣体（PSAM）へ移植し、球状タンパク質上で活性を詳細に評価を行う。これまでのアミロイド触媒で亜鉛をヒスチジンに配位させた構造が報告されているため、この構造の模倣から研究を開始した。PSAMのβシート上の片面にヒスチジンを24箇所と8箇所導入した変異体を作製した（それぞれCat-H24およびCat-H8と命名）。これらは人工遺伝子合成サービスを利用して、目的遺伝子を作った。Cat-H24およびCat-H8遺伝子を大腸菌組換え体として発現し、Ni-NTAカラムにて精製を行った。精製後のサンプルのpoly-Hisタグをスロンビン消化にて切断除去したサンプルを調製した。CDスペクトルにて元のPSAMと同様のβシートに富んだ構造を有していることを見出した。また、サイズ排除クロマトグラフィーの結果から、Cat-H24は実験条件にて主に二量体、Cat-H8は主に単量体として存在していることが明らかとなった。この二種類のPSAM変異体について、触媒活性をエステル加水分解と脱リン酸化反応で評価した。これら２つの反応を利用した理由は、反応生成物として色を持つ分子が生成する系を利用することで、簡便に反応速度論を評価することができるためである。触媒反応測定の結果、Cat-H24はエステル加水分解活性を持ち、金属イオンが不要であることが明らかとなった。これは報告のあるアミロイド触媒とことなるため反応メカニズムの解明を進めていく。また、脱リン酸化反応ではマグネシウムイオン依存的にCat-H24の触媒活性が現れることが明らかとなった。以上から、現時点でアミロイド触媒の触媒活性を移植したモデル蛋白質分子の設計に成功している。

在本研究中，我们将催化活性淀粉样蛋白（淀粉样蛋白催化剂）的部分序列移植到我们一直在研究的肽缔合模拟物（PSAM）上，并详细评估其在球状蛋白上的活性。由于之前的淀粉样蛋白催化剂中已报道了锌与组氨酸配位的结构，因此我们通过模仿该结构开始了我们的研究。我们创建了突变体，其中组氨酸被引入到 PSAM β-折叠一侧的 24 个和 8 个位点（分别命名为 Cat-H24 和 Cat-H8）。这些目标基因是使用人工基因合成服务创建的。 Cat-H24 和 Cat-H8 基因作为大肠杆菌重组体表达，并使用 Ni-NTA 柱纯化。通过用凝血酶消化从纯化的样品中去除聚组氨酸标签来制备样品。在CD谱中发现它具有与原始PSAM类似的富含β折叠的结构。此外，尺寸排阻色谱结果表明，在实验条件下Cat-H24主要以二聚体形式存在，而Cat-H8主要以单体形式存在。通过酯水解和去磷酸化反应评估这两种 PSAM 突变体的催化活性。使用这两个反应的原因是，通过使用产生有色分子作为反应产物的系统，可以容易地评估反应动力学。催化反应测量的结果表明，Cat-H24具有酯水解活性并且不需要金属离子。这与已报道的淀粉样蛋白催化剂不同，因此我们将继续阐明反应机制。此外，还发现Cat-H24的催化活性在去磷酸化反应中以镁离子依赖性方式出现。基于上述，我们成功地设计了一种模型蛋白质分子，其上接枝了淀粉样蛋白催化剂的催化活性。