Establishment of technologies of next-generation genetics in marsupial

有袋动物下一代遗传学技术的建立

基本信息

批准号：
21K06006
负责人：
清成寛
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06006/
关键词：
有袋類オポッサム生殖工学発生工学

项目摘要

有袋類であるハイイロジネズミオポッサム(以下、オポッサム)は、妊娠期間が14日間と非常に短く、未熟仔のまま生まれてくるため、器官形成を含む様々な発生イベントが出生後に起こるという従来のモデル動物には見られない非常にユニークな特徴を有する。本研究計画では、この特徴を活かした発生メカニズムの解明を目指し、遺伝子改変オポッサムの開発を進めると共に、F0世代における遺伝子機能解析を可能とする次世代型遺伝学的手法の基盤技術開発、更にはリソース化を目指した受精卵の凍結保存技術の確立を目的とする。昨年度までは、マイクロインジェクションに必要な受精卵を効率よく集めることに成功したため、当該年度は、F0世代による遺伝子機能解析を可能とする事に注力し、開発研究を実施した。これまでに3つの遺伝子座について、受精卵を用いたCRISPR/Cas9システムによるゲノム編集を試みたところ、3系統全てにおいて目的の遺伝子座に変異を導入することに成功した。この3系統については解析の結果、いずれの系統においても両アリルへの変異導入、すなわち標的遺伝子KOに成功していることが確認できた。内2系統については、実際にF0世代での遺伝子機能解析を実施している。また、マイクロインジェクションおよび移植を経て、得られた産仔数は少ないものの、得られた産仔における標的遺伝子KO効率は非常に高く、マイクロインジェクションに使用した受精卵のステージについても最適化ができたと考えられる。更には、系統保存を目指した凍結保存技術の確立についても平行して実施しているが、良好な結果が得られつつある。

灰鼠负鼠（以下简称负鼠），一种有袋动物，其妊娠期非常短，只有14天，而且是早产，因此传统的模型是包括器官形成在内的各种发育事件发生在出生后，具有非常独特的特征。在动物中没有发现。在本研究计划中，我们的目标是阐明利用这一特征的发育机制，我们将继续开发转基因负鼠，并开发下一代遗传方法的基础技术，使基因功能分析成为可能。 F0代的目的是建立受精卵冷冻保存技术，将其转化为资源。直到去年，我们已经成功地有效收集了显微注射所需的受精卵，因此今年我们重点关注如何利用F0代来分析基因功能，并进行了开发研究。到目前为止，我们已尝试使用受精卵使用CRISPR/Cas9系统编辑三个基因位点的基因组，并成功在所有三个菌株的目标基因位点引入突变。对这三个菌株的分析结果证实，在所有菌株中，两个等位基因都成功导入了突变，即实现了目标基因KO。对于其中两个品系，我们实际上是在 F0 代中进行基因功能分析。另外，虽然通过显微注射和移植获得的后代数量较少，但所得后代中的目的基因KO效率极高，并且用于显微注射的受精卵的阶段也得到了优化。此外，正在努力建立旨在保存菌株的冷冻保存技术，并取得了良好的结果。