Analyses of particle formation and infection mechanism for adeno-associated virus

腺相关病毒颗粒形成及感染机制分析

• 批准号: 20K07681
• 负责人: 大庭 賢二
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Jichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K07681/
• 关键词: 遺伝子治療; アデノ随伴ウイルス(AAV); ウイルス産生; ウイルス制御; ウイルス粒子形成; アデノ随伴ウイルス; ウイルス感染分子機構

アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの粒子形成と感染機構の解析を行い、今年度は以下の成果を得た。AAVベクターのウイルス粒子形成機構の解析のために、アデノ随伴ウイルス(AAV)のRep/Cap融合遺伝子をそれぞれ分離して、様々なプロモーターの下流に導入し、分離発現と発現制御を可能にした。また、野生型ウイルスの複製におけるRep遺伝子・Cap遺伝子の様々なスプライシングバリアントについても個別に発現制御可能なシステムを構築した。これらを用いて成熟したAAVの産生に関する解析を行い、AAVベクターの作製において効率の良いウイルス粒子形成条件を見出した。さらに、Cap遺伝子のそれぞれのスプライシングバリアントに個別のタグを導入し、ウイルス粒子形成機構のin vitro解析を行う準備を終えた。AAV感染レセプターの探索については、様々な抗体ライブラリーを用いた新たなウイルスレセプターの探索を行うために、まず既知のAAVレセプターであるAAVRを安定的に過剰発現する哺乳類細胞を樹立した。この細胞を用いて、生細胞を用いた抗体スクリーニングシステムの構築を行うための条件検討を行った。加えて、感染レセプターを同定する際に使用するために、AAV表面に特異的に結合する抗体のスクリーニングシステムを構築するための条件検討もおこなった。これらの条件検討から、「感染レセプターに結合する」、ならびに「AAV表面に結合する」抗体の単離に適した条件を見出し、新たな感染レセプターを単離するための準備が順調に整った。

我们分析了腺相关病毒（AAV）向量的颗粒形成和感染机制，并在今年获得了以下结果。为了分析AAV载体中病毒颗粒形成的机理，分离并在各种启动子的下游分离并引入了与腺相关病毒（AAV）的REP/CAP融合基因，从而可以进行分离和表达控制。此外，构建了一个能够在野生型病毒复制中分别控制rep和CAP基因各种剪接变体表达的系统。使用这些，我们分析了成熟AAV的产生，并发现了在AAV载体生产中形成病毒颗粒的有效条件。此外，将单个标签引入了CAP基因的每个剪接变体中，并完成制剂以对病毒颗粒形成机理进行体外分析。在搜索AAV感染的受体时，首先建立了稳定过表达已知AAV受体AAVR的哺乳动物细胞，以搜索新的病毒受体。使用这些细胞，检查了使用活细胞构建抗体筛选系统的条件。此外，还研究了针对特异性结合的抗体筛查系统的条件，该抗体特异性结合了AAV表面以识别受感染受体。已经研究了这些条件，以找到合适的条件，用于分离“与感染受体结合”和“与AAV表面结合”的抗体，并为分离新受感染的受体做出了很好的准备。