Development of gene therapy for hypophosphatasia

低磷酸酯酶基因治疗的进展

• 批准号: 20K08268
• 负责人: 三宅 弘一
• 金额: $ 2.83万
• 依托单位: Nippon Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K08268/
• 关键词: 低フォスファターゼ症; アルカリフォスファターゼ; アデノ随伴ウイルスベクター; 筋肉注射; 霊長類; 遺伝子治療; アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター; 低フォスファターゼ症; アルカリフォスファターゼ; アデノ随伴ウイルスベクター; 筋肉注射; 霊長類; 遺伝子治療; アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター

低フォスファターゼ症は組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNALP）遺伝子の異常によって発症する常染色体劣勢の先天性代謝異常症で、特に重症度の高い周産期型は全身の骨形成不全を伴って生後早期に死亡する。我々は低フォスファターゼ症の周産期型モデルマウスを使用し、TNALP発現アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターによる新規治療法（遺伝子治療）の研究を進めてきており、モデルマウスの延命効果や正常な骨形成などの良好な治療結果を得ている。本研究では今までの研究結果を基に、安全性の高いTNALP発現AAVベクターの１回の筋肉注射による新規治療法の実用化に向けて、本治療法の有効性と安全性を大型動物である霊長類を用いて検討を行う。本年度はTNALPを発現する組換えAAVベクターの作製を行い、霊長類（アカゲザル）への投与を行った。AAVベクター作成に関して、TNALPは筋肉内より分泌し骨親和性を持つようにSolubleのTNALPにD10を修飾したもの(TNALP-D10)を使用し、AAVベクターの血清型は筋肉細胞で発現効率が高い８型を使用した。作製したAAVベクタープラスミドとAAVのcap, rep発現パッケージングプラスミド及びヘルパープラスミドをHEK293細胞にPEI法にて遺伝子導入し、その細胞内及び上清よりAAVベクターを回収し、Iodexanolを用いた超遠心とカラムにより精製濃縮を行った。作製後AAVベクターの力価の測定を行い、in vitroでの発現の確認を行った。作成されたAAVベクターをHeLa細胞、C2C12細胞に遺伝子導入し、上清のALP活性を測定したところ十分な活性が認められた。このウイルスベクターをアカゲザルの外側広筋に投与（1x10*13 vg/ml)を行った。現在までに投与アカゲザルの血清中のALPの上昇を認めており、今後経過を追って観察してく。

下磷酸是由组织非特异性碱性磷酸酶（TNALP）基因异常引起的常染色体下先天性代谢疾病，而围产期类型尤其严重，在出生后早期出生后会因全身性骨骼形成损害而死亡。我们一直在使用低磷酸化的围产期模型小鼠，目前正在使用表达TNALP的腺相关病毒（AAV）载体研究新型疗法（基因疗法），并获得了良好的治疗结果，例如模型小鼠的延长效果和正常的骨骼形成。基于先前研究的结果，本研究将研究使用大动物，灵长类动物的治疗方法和安全性，以便使用单次肌内注射对高度安全的TNALP表达AAV载体进行新的治疗方法。今年，制备了表达tnalp的重组AAV载体并将其用于灵长类动物（恒河猴）。关于AAV矢量的创建，来自肌肉内部的可溶性TNALP分泌，并用D10（Tnalp-D10）修饰以具有磷酸化，而AAV载体血清型为8型，在肌肉细胞中具有高表达效率。使用PEI方法将制备的AAV载体质粒，AAV的CAP，REP表达包装质粒和AAV的辅助质粒转移到HEK293细胞中，并从细胞和超级段落中收集AAV载体，并使用iodexanol and Comenter和colums从细胞和超级段落中纯化和浓缩。制备后，测量了AAV载体的滴度，并在体外确认其表达。将生成的AAV载体转染到HeLa细胞和C2C12细胞中，并测量上清液的ALP活性以显示足够的活性。该病毒载体用于恒河猴（1x10*13 Vg/ml）的股外侧。迄今为止，已经观察到管理恒河猴的血清中ALP的增加，我们将继续观察进度。