電極支持生体膜反応場を用いたタンパク質間相互作用の理解とカスケード反応への展開

了解蛋白质-蛋白质相互作用并使用电极支持的生物膜反应场开发级联反应

基本信息

批准号：
21K05124
负责人：
加藤優
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

表面増強赤外吸収(SEIRA)活性を示すAu電極表面に電極支持生体膜反応場として脂質二重層(BLM)構築し，膜貫通型金属酵素とリン脂質または水溶性電子伝達タンパク質との相互作用による酵素活性への影響を主に調べた．リン脂質の種類，特にアシル基の鎖長がBLMのパッキング密度に影響を与えることがSEIRA分光計測の結果から明らかとなった．鎖長が長いほど密にパッキングする傾向があり，興味深いことに，電気化学的酵素活性はBLMが密にパッキングしている状態の方がより高くなることが明らかとなった．流動性の高い生体膜環境とは異なるが，膜貫通型金属酵素として用いた緑膿菌P. aeruginosa由来のチトクロムc依存型一酸化窒素還元酵素 (cNOR) および牛心筋由来のチトクロムc酸化酵素 (CcO) のどちらにおいても同様の傾向が観察された．これらの膜貫通型金属酵素はガスを基質とするため，BLMのパッキングと物質拡散が関係している可能性がある．水溶性電子伝達タンパク質との相互作用を調べるために，膜貫通型金属酵素としてCcOを，水溶性電子伝達タンパク質としてチトクロムc (cyt c) を用いて実験をした結果，電極表面への金属酵素固定化時に用いる自己組織化単分子層 (SAM) の構成分子であるアルカンチオールの末端官能基の割合によってCcOの電極表面でのタンパク質配向が変化し，cyt cとの吸着挙動が変化することが明らかとなった．また，cyt cとの吸着により，CcOの電気化学的酵素活性も変化することが明らかになった．これらの結果から，電極支持生体膜反応場を用いることで，比較的弱い相互作用である，リン脂質やタンパク質間相互作用によっても酵素活性が変化することを明らかにすることができた．

脂质双层（BLM）被构建为金电极表面上的电极支撑生物膜反应场，表现出表面增强红外吸收（SEIRA）活性，以及跨膜金属酶与磷脂或水溶性电子传递蛋白之间的相互作用我们主要研究了对酶活性的影响。 SEIRA 光谱测量表明，磷脂的类型，尤其是酰基的链长，会影响 BLM 的堆积密度。链长越长，BLM 堆积得越密集，有趣的是，当 BLM 紧密堆积时，电化学酶活性更高。尽管与高流动性生物膜环境不同，但使用源自铜绿假单胞菌的细胞色素c依赖性一氧化氮还原酶（cNOR）和源自牛心肌的细胞色素c氧化酶作为跨膜金属酶（CcO和CcO也观察到类似的趋势。由于这些跨膜金属酶使用气体作为底物，因此可能涉及 BLM 堆积和材料扩散。为了研究与水溶性电子传递蛋白的相互作用，我们使用CcO作为跨膜金属酶和细胞色素c（cyt c）作为水溶性电子传递蛋白进行实验，发现金属酶固定在电极表面很明显，CcO 电极表面上的蛋白质取向根据反应过程中使用的自组装单分子层 (SAM) 的构成分子烷硫醇的末端官能团的比例以及吸附行为而变化。随着 cyt c 的变化。还揭示了 CcO 的电化学酶活性在吸附细胞色素 c 后发生变化。从这些结果中，我们能够证明，通过使用电极支持的生物膜反应场，即使通过相对较弱的相互作用（例如磷脂和蛋白质相互作用）也可以改变酶活性。