Development of a novel lymphatic regeneration therapy by direct reprogramming

通过直接重编程开发新型淋巴再生疗法

• 批准号: 21K08833
• 负责人: 齊藤 幸裕
• 金额: $ 2.5万
• 依托单位: Asahikawa Medical College
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K08833/
• 关键词: ダイレクト・リプログラム; リンパ管; 静脈; ダイレクト・リプログラミング; リンパ浮腫; 再生医療

次世代再生医療であるダイレクト・リプログラミング(D-reP)技術を利用した、発生学的に同系列である静脈をリンパ管へと誘導するリンパ浮腫新規治療法の開発研究である。先行研究の結果からD-reP因子としてProx1とVEGFR-3が候補となることを見出した。しかしD-rePが上手く誘導できたかを確認するためのマーカーが必要である。そこでリンパ管内皮細胞(LEC)、伏在静脈内皮細胞(HSaVEC)、HUVECの3細胞培養系を用いて血管、リンパ管のマーカーとなる遺伝子発現について検索した。候補とした遺伝子は以下である;Prox1、HGF、Met、LYVE-1、Ets-1、Ets-2、VEGF-A、Sox18、 VEGFR-3、TGF-b1、FoxC2、ANGPT2、VEGF-C。これらのうちに常にLECでHSaVECとHUVECの両方より高発現していたのはProx1、VEGFR-3、ANGPT2、LYVE-1の4遺伝子のみであった。Prox-1とVEGFR-3はD-reP因子として利用することとしているため、ANGPT2とLYVE-1の発現によって確認することとした。さらにHSaVECにProx-1、VEGFR-3、Prox-1+VEGFR-3プラスミドを遺伝子導入しそれぞれの遺伝子が十分に発現するかをreal time PCRで確認した。 その結果、GFP導入群に比較してD-reP因子候補遺伝子が5日目まで十分に発現していることを確認した。さらにHSaVECにProx-1、VEGFR-3、Prox-1+VEGFR-3プラスミドを遺伝子導入し,マーカーとしたANGPT2とLYVE-1の遺伝子発現をreal time PCRで確認した。Prox-1、VEGFR-3の発現上昇を認めたが、ANGPT2とLYVE-1の発現に変化はなくHSaVECをLECへと誘導することはできなかった。

这项研究正在开发一种新的淋巴水肿治疗方法，该方法使用直接重编程（D-reP）技术（一种下一代再生医学）来引导胚胎学上相似的静脉到淋巴管。根据之前的研究结果，我们发现Prox1和VEGFR-3是D-reP因子的候选因子。然而，需要一个标记来确认 D-reP 是否已成功诱导。因此，我们使用三种细胞培养系统：淋巴内皮细胞（LEC）、隐静脉内皮细胞（HSaVEC）和HUVEC，寻找可作为血管和淋巴管标志物的基因表达。候选基因为：Prox1、HGF、Met、LYVE-1、Ets-1、Ets-2、VEGF-A、Sox18、VEGFR-3、TGF-b1、FoxC2、ANGPT2、VEGF-C。其中，只有 Prox1、VEGFR-3、ANGPT2 和 LYVE-1 四种基因在 LEC 中的表达始终高于 HSaVEC 和 HUVEC。由于 Prox-1 和 VEGFR-3 将用作 D-reP 因子，因此我们决定通过 ANGPT2 和 LYVE-1 的表达来证实这一点。此外，将Prox-1、VEGFR-3和Prox-1+VEGFR-3质粒导入HSaVEC，并通过实时PCR确认各基因是否充分表达。 结果，确认与GFP导入组相比，D-reP因子候选基因直到第5天都充分表达。此外，我们用Prox-1、VEGFR-3和Prox-1+VEGFR-3质粒转染HSaVEC，并通过实时PCR确认ANGPT2和LYVE-1作为标记物的基因表达。虽然观察到Prox-1和VEGFR-3的表达增加，但ANGPT2和LYVE-1的表达没有变化，并且HSaVEC不能诱导为LEC。