Significance and mechanism of mutually exclusive inactive histone marks

互斥的无活性组蛋白标记的意义和机制

基本信息

批准号：
21H04764
负责人：
木村宏
金额：
$ 26.71万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-05 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

ヒストンH3K27のトリメチル化（H3K27me3）とクロマチンにH3K9のトリメチル化（H3K9me3）の排他性を明らかにするために、H3K27me3が濃縮される場所にH3K9me3を導入する系を作製している。昨年度の研究で、ラパマイシンを用いた二量体化の誘導によりH3K27me3が濃縮される不活性X染色体上にH3K9me3を導入できることが明らかになった。また、その時間経過は比較的ゆっくりであったことから、必ずしも二量体化誘導系を用いる必要はないということがわかった。そこで、H3K27me3特異的細胞内抗体（H3K27me3-mintbody）にH3K9のトリメチル化酵素Suv39H2のメチル化活性(SET)ドメインを融合した蛋白質（H3K27me3-mintbody-Suv39H2(SET)）、及び、メチル化活性をもたないSETドメインの変異体（methyltransferase-deficient SET; dSET)を融合し蛋白質（H3K27me3-mintbody-Suv39H2(dSET)）をドキシサイクリン依存的に発現するマウス細胞株を樹立した。H3K27me3-mintbody-Suv39H2(SET)の発現をドキシサイクリンで誘導すると数時間後に蛍光が見られ、不活性X染色体上への局在も確認できた。現在、細胞の表現型の解析を進めている。生細胞でH3K9me3が濃縮する部位を可視化できるプローブに関しては、Suv420H2のヘテロクロマチン局在化ドメイン中のヘテロクロマチン蛋白質１（HP1）に結合部位を用いて開発を進めている。これまでの研究でN末端側のHP1結合モチーフを含む領域は結合力が強すぎて生細胞プローブに向かないことがわかったが、今回、C末端側の結合モチーフを含む領域が適度にHP1に結合すること示すことができた。このC末端側の30アミノ酸程度の領域は、生細胞中のクロマチン状態に影響を与えずに、HP1を介してH3K9me3の局在解析に使用できると考えられた。

为了阐明染色质中组蛋白 H3K27 三甲基化 (H3K27me3) 和 H3K9 三甲基化 (H3K9me3) 的排他性，我们正在创建一个系统，将 H3K9me3 引入到 H3K27me3 富集的位置。去年的研究表明，H3K9me3 可以被引入到失活的 X 染色体上，其中 H3K27me3 通过使用雷帕霉素诱导二聚化而富集。此外，由于时间进程相对较慢，因此发现不一定需要使用二聚化诱导系统。因此，我们开发了一种蛋白质（H3K27me3-mintbody-Suv39H2(SET)），其中H3K9三甲基转移酶Suv39H2的甲基化活性（SET）结构域与H3K27me3特异性细胞内抗体（H3K27me3-mintbody）融合，并且还具有具有甲基转移酶缺陷 SET 结构域的突变体（methyltransferase-deficient SET；我们建立了一种小鼠细胞系，通过与 dSET 融合，以多西环素依赖性方式表达蛋白质 (H3K27me3-mintbody-Suv39H2(dSET))。当用强力霉素诱导H3K27me3-mintbody-Suv39H2（SET）的表达时，数小时后观察到荧光，并且也证实了其定位在失活的X染色体上。我们目前正在分析细胞表型。我们目前正在开发一种探针，可以使用 Suv420H2 异染色质定位域中异染色质蛋白 1 (HP1) 的结合位点来可视化活细胞中 H3K9me3 集中的位点。之前的研究表明，N端含有HP1结合基序的区域结合强度太强，不适合活细胞探针，但这次，我们发现C端含有结合基序的区域终端侧对HP1具有中等的结合力，我能够证明它可以结合。人们认为这个约 30 个氨基酸的 C 端区域可用于通过 HP1 对 H3K9me3 进行定位分析，而不影响活细胞中的染色质状态。