マウスP1タンパク質のリン酸化制御

小鼠P1蛋白的磷酸化调控

基本信息

批准号：
07780589
负责人：
木村宏
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780589/
关键词：
cell cycle DNA replication licensing factor MCM3 mouse nuclear localization signal P1 protein phosphorylation

项目摘要

MCMタンパク質は、細胞周期のM期の終了時にクロマチンと結合し、S期にDNA複製の進行に伴ってクロマチンから遊離することで、DNA複製が一度の細胞周期で唯一度だけ起こるための調節に関与している。出芽酵母MCM3がS期に核から細胞質へ移動するのに対し、そのホモログであるマウスP1/MCM3タンパク質はクロマチンから遊離しても核に局在する。しかしながら、クロマチンと結合したタンパク質に比べて遊離したP1/MCM3は、高度にリン酸化を受けている。そこで、P1/MCM3のリン酸化部位とそのリン酸化酵素の同定を試みた。大腸菌で作製したGST-P1/MCM3融合タンパク質を其質として、様々なリン酸化酵素を用いてリン酸化反応を行った。その結果、カゼインキナーゼ2(CKII)、DNA依存性プロテインキナーゼ(DNK-PK)、Cdc2/cyclin B、Cdc2/cyclin Aにより、P1/MCM3がリン酸化され、G1 cyclin/Cdkではリン酸化されなかった。今回、そのうちCKIIによるリン酸化部位は、bipartite型の核移行シグナルのスペーサー領域に存在することを突き止めた。実際、この部分のフォスフォペプチドマップはin vivoのリン酸化によるマップと一致しており、in vivoでもリン酸化されていると考えられた。そこで、そのリン酸化が核移行に影響を与えているかどうかを確かめるため、セリン及びスレオニンをアラニンに置換した変異体を作製し、トランスフェクションにより、その局在を観察した。その結果、変異体は核に局在し、核移行シグナル部分のCKIIによるリン酸化は、核への輸送に必要ではないということが明らかになった。また、DNA-PKによるリン酸化部位もP1/MCM3のC末端付近に存在することも明らかになり、そのリン酸化がクロマチンとの結合にどう影響するか興味が持たれる。

MCM 蛋白在细胞周期的 M 期末期与染色质结合，并在 S 期随着 DNA 复制的进行而从染色质中释放出来，从而调节 DNA 复制在每个细胞周期中仅发生一次。虽然酿酒酵母 MCM3 在 S 期从细胞核移动到细胞质，但其同源物小鼠 P1/MCM3 蛋白即使从染色质释放，也定位于细胞核。然而，与染色质结合蛋白相比，游离 P1/MCM3 高度磷酸化。因此，我们试图鉴定P1/MCM3及其磷酸化酶的磷酸化位点。以大肠杆菌产生的GST-P1/MCM3融合蛋白为底物，使用各种磷酸化酶进行磷酸化反应。结果，P1/MCM3 被酪蛋白激酶 2 (CKII)、DNA 依赖性蛋白激酶 (DNK-PK)、Cdc2/细胞周期蛋白 B 和 Cdc2/细胞周期蛋白 A 磷酸化，但不被 G1 细胞周期蛋白/Cdk 磷酸化。在这里，我们发现 CKII 的磷酸化位点位于二分型核输出信号的间隔区。事实上，该区域的磷酸化肽图谱与体内磷酸化图谱一致，表明它在体内也被磷酸化。因此，为了确认磷酸化是否影响核转位，我们创建了丝氨酸和苏氨酸被丙氨酸取代的突变体，并通过转染观察其定位。结果表明，突变体定位于细胞核，并且核转运不需要CKII对核定位信号的磷酸化。研究还表明，P1/MCM3 C 末端附近存在 DNA-PK 磷酸化位点，观察这种磷酸化如何影响其与染色质的结合很有趣。