反応性アストロサイト制御分子PAK2キナーゼの機能解析

反应性星形胶质细胞调节分子PAK2激酶的功能分析

基本信息

批准号：
21K06598
负责人：
小椋正人
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Fukushima Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

代謝に伴うROS発生については、神経変性疾患をはじめとする種々の加齢性疾患の発症要因の一つとされている。申請者はこれまでミトコンドリアc-Srcによる呼吸鎖複合体IIのsuccinate dehydrogenase A (SDHA)サブユニットの215番目のチロシンリン酸化がROS産生の抑制に必須の役割を持つことを見出してきた。さらに、アストロサイト群特異的に代謝性ROSの増加を示すSDHAY215Fリン酸化部位変異体発現トランスジェニック（Tg）マウスを作出し、運動協調性の低下、黒質におけるグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）、A1アストロサイトマーカーC3および神経毒性因子Tinagl1分子陽性細胞数の増加とチロシン水酸化酵素（TH）陽性神経細胞の減少を引き起こすことを見出した。本研究では、代謝性ROSに起因する反応性アストロサイトによるドパミン神経損傷メカニズムの解明を目的として、アストロサイト由来分泌因子Tinagl1の発現調節メカニズムの解析を行った。マウスTinagl1プロモーターをクローニングした後、ルシフェラーゼ発現ベクターに組込んだ。プロモーター領域の生物データベース解析から複数の転写因子が発現調節に関わることが示唆された。プロモーター領域のデリーション変異体および部分配列変異体を作製し、レポーターアッセイを行ったところ、p53結合領域がTinagl1発現調節に重要な役割を果たしていることが判明した。p53をターゲットとするsiRNAを用いた発現抑制実験を行い、p53がTinagl1発現に関わることを確認した。さらに、In vitroキナーゼアッセイおよびウエスタンブロットを行い、PAK2がp53のリン酸化および安定化に関わることを見出した。これらの解析から反応性アストロサイトにおいてp53を介するPAK2の新規シグナル経路の存在が明らかとなった。

与代谢相关的ROS的发展被认为是引起各种年龄相关疾病（包括神经退行性疾病）的因素之一。申请人先前已经发现，线粒体C-SRC在琥珀酸脱氢酶A（SDHA）亚基II的琥珀酸脱氢酶A（SDHA）亚基处的酪氨酸磷酸化在抑制ROS产生中具有至关重要的作用。 Furthermore, we produced transgenic (Tg) mice expressing SDHAY215F phosphorylation site mutant that specifically exhibited increased metabolic ROS in the astrocyte group, and found that it caused decreased motor coordination, increased numbers of glial fibrotic acid protein (GFAP), A1 astrocyte marker C3 and neurotoxic factor Tinagl1 molecule positive cells, and decreased tyrosine羟化酶（Th） - 阳性神经元。在这项研究中，我们分析了星形胶质细胞衍生的分泌因子Tinagl1的表达调节机制，目的是阐明由代谢性ROS引起的反应性星形胶质细胞引起的多巴胺神经损伤的机制。克隆小鼠Tinagl1启动子，然后掺入荧光素酶表达载体中。启动子区域的生物数据库分析表明，表达调控涉及多个转录因子。产生了启动子区域的缺失和子序列变体，报告者的测定法显示，p53结合区域在调节Tinagl1表达中起重要作用。使用靶向p53的siRNA进行了表达抑制实验，并证实p53参与了tinagl1表达。另外，进行了体外激酶测定和蛋白质印迹，发现PAK2参与了p53的磷酸化和稳定化。这些分析揭示了反应性星形胶质细胞中P53的新型信号途径的存在。