Mechanism of the apoptotic program of eggs blocked by fertilization

受精阻断卵细胞凋亡程序的机制

基本信息

批准号：
21K06185
负责人：
千葉和義
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Ochanomizu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06185/
关键词：
ヒトデ卵母細胞アポトーシス受精 caspase-3/9 Apaf-1 電子顕微鏡自己切断卵

项目摘要

本年度の研究によって、大腸菌リコンビナントCARDを用いて、クライオ顕微鏡観察によってCARDフィラメント構造が明らかになった。哺乳類における他のcaspaseにおけるCARDフィラメントと同様に、I,II,IIIの結合面を持っていることも明らかになった。このフィラメントが真にアポトーシスにおいて形成されていることを確かめるために、CARDを含む全長caspase-3/9のリコンビナントタンパク質を合成して、フィラメント形成が起こるかどうかを調べている。その研究過程で、活性型caspase-3/9では自己切断によって、タンパク質を安定的に維持できない問題が生じた。そこで、活性中心のアミノ酸を突然変異させたcaspase-3/9を作成した。大腸菌の中で発現すると、フォールディングがしっかりと起きないことが危惧されたので、小麦胚芽発現系を用いて合成している。現在、ネガティブ染色法で電子顕微鏡観察を行い、フィラメント形成が起こっているかどうかを調べている。さらに、切断前の不活性型caspase-3/9が重合caspase-3/9 CARDと結合し、活性型となることを証明するために、自己切断部位の突然変異型caspase-3/9を作成した。それが、重合caspase-3/9 CARDと相互作用するか、そして活性化するかどうかを、低分子性の蛍光基質を用いて確認したところ、CARDによって活性が上昇することを検出できた。したがって、切断前の不活性型caspase-3/9がCARDフィラメントによって活性型に変化することが、確かめられた。

今年的研究揭示了使用大肠杆菌重组卡通过冷冻显微镜进行的卡丝结构。还显示出它具有I，II和III结合表面，类似于哺乳动物中其他胱天蛋白酶中的卡丝。为了确保这种细丝在凋亡中真正形成，合成了全长caspase-3/9重组蛋白的重组蛋白，以确定是否发生丝状形成。在研究过程中，主动caspase-3/9引起了一个问题，即由于自切断，蛋白质无法稳定地保持。因此，创建了caspase-3/9，其中活性中心的氨基酸被突变。人们担心在大肠杆菌中表达时不会发生折叠，因此使用小麦细菌表达系统合成。目前，正在使用负染色观察到电子显微镜，以确定是否发生了细丝形成。此外，为了证明裂解之前的无活性caspase-3/9与聚合caspase-3/9卡结合并变为活动形式，在自裂解位点创建了突变的caspase-3/9。当使用小荧光底物确认它是否与聚合caspase-3/9卡相互作用并激活它时，可以检测到卡会增加其活性。因此，已经证实，在裂解之前，通过卡丝将裂解之前的无活性caspase-3/9转化为活动形式。