蛍光偏光度測定による細胞内蛋白質リン酸化反応の可視化

通过荧光偏振测量可视化细胞内蛋白质磷酸化反应

基本信息

批准号：
09780650
负责人：
千葉和義
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Ochanomizu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞生物学が対象としている多くの生命現象に、蛋白質リン酸化反応は関わっている。その反応の検出には、ラジオアイソトープやリン酸基に対する抗体などが用いられてきたが、基本的に破壊検査を伴っている。生きた細胞のまま、すなわちin vivo,in situ,さらにreal temeでリン酸化反応を検出できる技術は知られていない。本研究では、そのような技法の確立を目指し、リン酸基と結合する蛍光物質を作成し、蛍光偏光度を測定することによって、リン酸化された蛋白質の量を定量する。そのために、蛋白質のリン酸基と結合するペプチド断片を、ファージまたは大腸菌表面蛋白質に発現させたペプチドライブラリーを用い作成し、蛍光物質(FITCなど)でラベルする。次に、蛍光偏光度を測定することによって、蛍光ペプチド断片とリン酸基との結合をモニターし、リン酸化された蛋白質の量を定量する。9〜10年度にかけて、この目的達成のために、大腸菌表面にランダムペプチドを発現するライブラリー(FliTrx random peptide display library)を用いた。リン酸化チロシンと結合するペプチドを発現しているものを、クローニングするために、リン酸化チロシンをビオチン化した。次に、ビオチン化リン酸化チロシンをアビジンコートされたプレートに結合させ、これに結合する大腸菌を回収した。大腸菌をアガープレートにまいて、得られたクローンをそれぞれ再度培養した。次にそれぞれのクローンが真にリン酸化チロシンに結合するペプチドを発現しているか否かを明らかにするために、FITCラベルしたリン酸化チロシンを作成し、蛍光偏光度の変化を指標にしてスクリーニングしたが、ポジティブなクローンは得られなかった。残念ながら、十分に強く結合するペプチド配列が存在しない可能性が考えられた。現在、ファージ表面にランダムペプチドを発現するライブラリーを使用して、同様な実験を行っているが、良い結果は今のところ得られていない。パニングの条件を色々検討することで、何とか成功させたいと努力している。

蛋白质磷酸化涉及细胞生物学中的许多生命现象。使用放射性异位素和磷酸基团的抗体检测到该反应，但基本上伴随着破坏性测试。众所周知，尚无已知技术能够检测体内或真实诱因中的磷酸化反应。在这项研究中，我们旨在建立这种技术，并通过创建与磷酸基团结合并测量荧光极化程度的荧光物质来量化磷酸化蛋白质的量。为此，使用在噬菌体或大肠杆菌表面蛋白上表达并用荧光物质（例如FITC）标记的肽库制备与蛋白质磷酸基团结合的肽片段。然后，通过测量荧光极化程度来监测荧光肽片段与磷酸基团的结合，并定量磷酸化蛋白的量。从1990年到1990年，为了实现这一目标，使用了在大肠杆菌表面表达随机肽的文库（Flitrx随机肽显示库）。磷酸化的酪氨酸被生物素化，以克隆那些表达与磷酸化酪氨酸结合的肽的酪氨酸。然后，将生物素基化的磷酸化酪氨酸结合到抗生蛋白蛋白涂层的板上，并收集到与此结合的大肠杆菌。将大肠杆菌倒在琼脂板上，并重新培养所得的克隆。接下来，为了确定每个克隆是否真正表达与磷酸化的酪氨酸，FITC标记的磷酸化酪氨酸结合的肽，并使用荧光偏振的变化作为指标创建并筛选，但没有获得阳性克隆。不幸的是，被认为可能没有足够强的结合肽序列。当前，使用在噬菌体表面表达随机肽的文库进行类似的实验，但到目前为止尚未获得良好的结果。通过考虑各种平移条件，我们正在努力使其成功。