培養温度制御に基づく真核細胞への遺伝子導入の効率化

基于培养温度控制提高基因转移至真核细胞的效率

基本信息

批准号：
21K04789
负责人：
勝田知尚
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では，研究代表者らが緑藻の培養で見出した，培養温度を適切な範囲で周期的に変化させると培養液中の細胞間で細胞周期が同調するという知見に基づき，真核細胞の細胞周期を同調させて核膜の消失から再構成される間にあわせて外来遺伝子を導入することにより，その核内移行，ならびに核 DNA との接触を促進させて，遺伝子導入の効率化を図ることを目的としている．令和 4 年度は，昨年度から引き続き，子宮頸がんやインフルエンザ，さらに新型コロナウイルス感染症のワクチン生産に用いられている昆虫細胞に注目し，組換えタンパク質の高発現を期待できるとされる Trichoplusia ni BTI-TN-5B1-4 (High Five) 細胞を対象として実験を行った．培養温度をプログラム制御したインキュベーター内で連続的にモニタリングされた細胞密度の増加とともに，培養中に経時的に収穫したサンプルのフローサイトメーター分析による細胞内の核酸含有量の変化から，細胞周期の同調の観察を行った．はじめに，細胞周期阻害剤の添加により，細胞周期の進行を所定の期で停止させたときの細胞内核酸含有量の経時的変化を調べた．G2/M 期で停止させる阻害剤では細胞内核酸含有量のピークに無添加条件からの変位は生じなかったが，G1/S 期で停止させる 2'-デオキシ-5-フルオロウリジン (FdUrd) では無添加条件のピークよりも低含有量側にピークが変位することを見出した．つぎに，培養温度を最適温度の 27℃ より低下させたときの細胞内核酸含有量の経時的変化を調べた．その結果，培養温度 17℃ では，FdUrd と同様に，無添加条件のピークよりも低含有量側へのピーク変位が見られた．以上のことから，High Five 細胞では多くの細胞が G2 期にあり，またそれが長時間維持されることが示唆された．

基于在绿藻培养中发现的发现，当培养温度在适当范围内周期性变化时，细胞周期在培养基中的细胞之间会调节。这项研究的目的是通过调整真核细胞的细胞周期并引入外国基因，同时从核膜消失中重建，从而促进核易位并与核DNA接触，从而促进核易位并与核DNA接触。在2022财年，与去年一样，我们专注于用于生产宫颈癌，流感和新型冠状病毒感染的疫苗，并进行了对毛状乳状体Ni BTI BTI-TN-5B1-4（高五个）细胞的实验，据预计，这些细胞可产生重新表达的蛋白质。基于细胞密度的增加观察细胞周期同步，该细胞密度的增加在具有编程培养温度的孵化器中连续监测，以及通过流式细胞仪分析在培养过程中随时间收获的样品的流式细胞仪分析，在细胞中的核酸含量变化。首先，我们研究了细胞周期进程通过添加细胞周期抑制剂在指定阶段停止的细胞内核酸含量的变化。在G2/M期停止的抑制剂不会从无添加剂条件中取代细胞内核酸含量的峰值，但我们发现，在2'-脱氧-5-氟尿苷（FDURD）中，在G1/S相停止的G1/S相停止，该相位是在低于添加添加的条件的峰值峰位置的峰值。接下来，我们研究了随着时间的推移，培养温度降低到27°C的最佳温度时，细胞内核酸含量的变化。结果，在17°C的培养温度下，观察到无添加条件下峰较低含量侧的峰位移，类似于FDURD。以上表明，高五个细胞中的许多细胞处于G2相，并且这些细胞长期保持。