The pursuit of both brightness and photostability in fluorescent protein technology

荧光蛋白技术对亮度和光稳定性的追求

基本信息

批准号：
21H05041
负责人：
宮脇敦史
金额：
$ 105.91万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-07-05 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

蛍光タンパク質の「明るさ」と「光安定性（褪色しにくさ）」の間にはトレードオフがあると考えられている。これまで多くの変異体が「明るさ」を追求して開発されてきたが、ほぼ全て「光安定性」を犠牲にした所産である。褪色は、対象を明るく標識して観る場合は心配ないが、導入蛍光分子の量に厳しい制限がある場合に深刻な問題となる。少コピー数の分子種をある時間連続して追跡する実験では、蛍光分子に高い「光安定性」が要求される。従来は量的にも「明るさ」偏重の傾向があり、導入蛍光タンパク質の発現制限の是非はあまり真剣に議論されてこなかった。昨今のゲノム編集技術を駆使することで、導入蛍光タンパク質の少コピー数発現制御が可能である。本研究は、「明るさ」対「光安定性」のトレードオフの実体を把握しながら、我々が最近に作製した新規蛍光タンパク質をベースに、質的に明るくかつ褪色しない蛍光標識技術を開発することを目的とする。研究代表者らは、タマクラゲから新規にクローニングした緑色蛍光タンパク質を元に改変を行い、優れた実用的な明るさ（モル吸光係数、蛍光量子収率、発色団形成スピード）を示しながら、ケーラー照明型蛍光顕微鏡観察（放射照度：~ 10 W/cm2）において全く褪色しない蛍光タンパク質StayGoldを作製することに成功した。StayGoldと超解像顕微鏡法（SIM）を組み合わせることにより、細胞小器官（ミトコンドリアおよび小胞体）の高速、長時間、高空間分解能の観察に成功した。たとえば、小胞体構造は高時空間分解能で観察すると振動運動していることが明らかにされているが、小胞体から細胞質へのカルシウムイオン放出時に小胞体の振動運動が抑制されるという現象を新たに発見した。

人们认为荧光蛋白的“亮度”和“光稳定性（抗褪色）”之间存在权衡。到目前为止，许多突变体都是为了追求“亮度”而开发出来的，但几乎所有突变体都是牺牲“光稳定性”的结果。当目标被明亮地标记和观察时，变色不是问题，但当引入的荧光分子的量受到严格限制时，变色就成为一个严重的问题。在一定时间内连续追踪低拷贝数分子种类的实验中，要求荧光分子具有较高的光稳定性。传统上，存在过于强调数量上的“亮度”的倾向，并且没有认真讨论限制引入的荧光蛋白的表达的利弊。通过充分利用最新的基因组编辑技术，可以控制引入的荧光蛋白的小拷贝数的表达。在这项研究中，我们将基于我们最近创建的一种新荧光蛋白，开发一种质量明亮且不褪色的荧光标记技术，同时了解“亮度”和“光稳定性”之间权衡的现实。目的是主要研究人员对从球水母中新克隆的绿色荧光蛋白进行了修饰，在表现出优异的实用亮度（摩尔消光系数、荧光量子产率和发色团形成速度）的同时，他们成功地将其用于科勒照明。产生一种荧光蛋白 StayGold，在荧光显微镜（辐照度：~10 W/cm2）下观察时它根本不会褪色。通过将StayGold与超分辨率显微镜（SIM）相结合，我们成功地以高空间分辨率高速、长时间地观察细胞器（线粒体和内质网）。例如，已经揭示，当以高时空分辨率观察时，内质网结构表现出振荡运动，但我们发现了一种新现象，即当钙离子从内质网释放到水中时，内质网的振荡运动受到抑制。中发现的细胞质。