The pursuit of both brightness and photostability in fluorescent protein technology

荧光蛋白技术对亮度和光稳定性的追求

基本信息

批准号：
21H05041
负责人：
宮脇敦史
金额：
$ 105.91万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-07-05 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

蛍光タンパク質の「明るさ」と「光安定性（褪色しにくさ）」の間にはトレードオフがあると考えられている。これまで多くの変異体が「明るさ」を追求して開発されてきたが、ほぼ全て「光安定性」を犠牲にした所産である。褪色は、対象を明るく標識して観る場合は心配ないが、導入蛍光分子の量に厳しい制限がある場合に深刻な問題となる。少コピー数の分子種をある時間連続して追跡する実験では、蛍光分子に高い「光安定性」が要求される。従来は量的にも「明るさ」偏重の傾向があり、導入蛍光タンパク質の発現制限の是非はあまり真剣に議論されてこなかった。昨今のゲノム編集技術を駆使することで、導入蛍光タンパク質の少コピー数発現制御が可能である。本研究は、「明るさ」対「光安定性」のトレードオフの実体を把握しながら、我々が最近に作製した新規蛍光タンパク質をベースに、質的に明るくかつ褪色しない蛍光標識技術を開発することを目的とする。研究代表者らは、タマクラゲから新規にクローニングした緑色蛍光タンパク質を元に改変を行い、優れた実用的な明るさ（モル吸光係数、蛍光量子収率、発色団形成スピード）を示しながら、ケーラー照明型蛍光顕微鏡観察（放射照度：~ 10 W/cm2）において全く褪色しない蛍光タンパク質StayGoldを作製することに成功した。StayGoldと超解像顕微鏡法（SIM）を組み合わせることにより、細胞小器官（ミトコンドリアおよび小胞体）の高速、長時間、高空間分解能の観察に成功した。たとえば、小胞体構造は高時空間分解能で観察すると振動運動していることが明らかにされているが、小胞体から細胞質へのカルシウムイオン放出時に小胞体の振動運動が抑制されるという現象を新たに発見した。

人们认为，荧光蛋白的“亮度”和“光稳定性（抗褪色）”之间存在权衡。许多突变体是为了追求“亮度”而开发的，但几乎所有突变体都是以“光稳定性”为代价的。当对该主题上的亮标签观看时，褪色并不是问题，但是当严格限制那里引入的荧光分子量时，这将成为一个严重的问题。在一定时间段内连续跟踪小拷贝数分子物种的实验需要高荧光分子的“光稳定”。过去，在定量含量方面倾向于强调“亮度”，并且对引入的荧光蛋白表达的限制并未非常认真地讨论。通过充分利用最近的基因组编辑技术，可以控制引入的荧光蛋白的小拷贝数表达。这项研究旨在根据我们最近创建的新型荧光蛋白来开发一种定性且非倒入的荧光标签技术，同时了解“亮度”与“光稳定性”之间权衡的真实性质。研究人员成功地创建了一种荧光蛋白持久性，该荧光蛋白不会在Kohler照明型荧光显微镜观察（辐照度：〜10 w/cm2）下使用新近克隆的绿色荧光蛋白，从水仙鱼开始，显示出极好的实用亮度（摩尔灭绝系数，荧光系数，荧光量子量子量，Chromophophore speed）。通过将Staygold与超分辨率显微镜（SIM）相结合，我们成功地观察到了细胞器（线粒体和内质网）的高速，长期的高空间分辨率。例如，已经表明，在高时空分辨率下观察到内质网的结构是振荡性的，但是我们发现了一种新现象，其中钙离子从内胞质网释放到cytoplum smasm释放时会抑制内质网的振荡运动。