IP3結合蛋白質の分子デザインによる細胞内IP3/Ca^<2+>シグナリングの解析

通过 IP3 结合蛋白的分子设计分析细胞内 IP3/Ca^<2+> 信号传导

• 批准号: 06780579
• 负责人: 宮脇 敦史
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780579/
• 关键词: イノシトール3リン酸(IP3); Ca^<2+>カルシウム; GFP; 螢光エネルギー転移; イノシトール3リン酸(IP3); Ca^<2+>カルシウム; GFP; 螢光エネルギー転移

1。IP3結合蛋白質の分子デザインマウス小脳タイプ(タイプI)IP3受容体cDNAよりN末端736アミノ酸をコードする部分をIP3インジケイタ-としてのIP3結合蛋白質に用いた。N末端にセリン残基、C末端にリジン残基を遺伝子工学的手法を用いて導入し、特異的蛍光ラベルを可能にした。N末端セリンを過ヨウ素酸で処理し、アルデヒド基を、C末端リジンにはヒドラジドができるため、それぞれ求電子、求核性の蛍光プローブをラベルできる。また米国カリフォルニア大学のTsien博士の研究室ではGFP(green-fluoresence-protein)を改変するプロジェクトを推進めている。GFP蛋白質は、何らcofactorを必要とせず蛍光を発し得る為、蛍光プローブの細胞内遺伝子導入を可能にする画期的なツールである。様々な改変GFP蛋白質は、異なる吸収、蛍光スペクトラムを示し、蛍光エネルギー転移を可能にする幾つかの組み合わせが見つかっている。我々は、これら改変GFP遺伝子をTsien博士から分与してもらい、IP3結合蛋白質の両末端に連結させた。これにより、IP3結合蛋白質の精製-蛍光ラベル-細胞内注入、という一連の操作の省略が期待できる。これら蛋白質を大量に発現するべくバキュロウイルス-昆虫細胞の発現系、大腸菌の発現系を確立し、数mg以上の蛋白質を回収した。2。IP3結合蛋白質の基本的特性インヴィトロ実験により、この蛋白質の基本的特性に関してデータをとった。IP3の結合でどの程度の構造変化が起こるのかをゲル濾過実験検討した。GFP連結蛋白質について、励起、蛍光の波長ピークを解析したが、IP3の有無で蛍光エネルギー転移の著明な変化はなかった。更に異なる改変蛋白質の連結を計画している。

1。IP3结合蛋白的分子设计，用小鼠小脑型（I型）IP3受体cDNA编码N端736氨基酸的部分用作IP3结合蛋白作为IP3指示剂。使用基因工程方法引入了N端处的丝氨酸残基和C末端的赖氨酸残基，以实现特定的荧光标记。 N末端丝氨酸用周期酸处理，并形成醛组，并形成C末端赖氨酸，分别允许对亲电和亲核荧光探针进行标记。美国加利福尼亚大学的Tsien博士实验室还在促进一个修改GFP（绿色 - 荧光蛋白）的项目。 GFP蛋白是一种开创性的工具，可允许荧光探针的细胞内基因转移，因为它们可以发射荧光而无需任何辅助因子。各种修饰的GFP蛋白表现出不同的吸收，荧光光谱，并且发现了几种允许荧光能量转移的组合。我们从Tsien博士那里收到了这些改良的GFP基因，并将它们与IP3结合蛋白的两端联系起来。这可以预期消除一系列程序，例如纯化IP3结合蛋白，荧光标记和细胞内注射。为了表达大量这些蛋白质，建立了杆状病毒诱导的细胞表达系统和大肠杆菌表达系统，并收集了几种mg或更多的蛋白质。 2。通过体外实验收集了IP3结合蛋白数据的基本表征。我们研究了凝胶过滤实验，以确定IP3结合发生时结构变化的程度。分析了GFP连接蛋白的激发和荧光波长峰，但由于存在或不存在IP3，荧光能量转移没有显着变化。此外，还计划了不同修饰蛋白的连接。