异化金属还原细菌胞外电子转移能力的荧光探针表征

Dissimilatory metal-reducing bacteria (DMRB) can transfer the electrons generated from substrate metabolism, through unique extracellular electron transfer (EET) chains, to various external electron acceptors. Therefore, they play important roles in geochemical cycles of multiple elements as well as in environmental remediation, wastewater treatment and energy conversion processes. Isolating DMRB and characterize their EET ability is thus essential for us to better understand and utilize these bacteria. In this project, we are planning to develop a novel fluorescent spectrometric method for both qualitative characterization and quantitative determination of the EET ability of DMRB. This method shall use some special fluorescent probe as electron acceptors, whose fluorescent properties will change upon accepting electrons from DMRB. Compared with conventional methods, this approach shall be more rapid, sensitive, simple and enables in-situ detection. Moreover, theoretical calculation shall also be adopted to further validate and elucidate the mechanism of such a fluorescent-probing method from a molecular level. The method developed in this project shall be used as a useful tool in molecular biology platform for EET chain study, and provide theoretical basis and technological guidance for both fundamental study and application of DMRB.

异化金属还原细菌(DMRB)能够将胞内代谢产生的电子传递通过特殊的电子传递链给胞外的电子受体，在多种元素的地球化学循环、环境修复、废水处理和能量转化等过程中都发挥重要作用。通过分离DMRB并对其胞外电子转移能力进行定性表征和定量检测，将有助于我们更好的了解和利用这类微生物，因此具有重要的研究意义。本项目拟建立一套荧光探针法，通过特殊荧光探针分子荧光特性的变化来反映电子的转移情况，从而实现环境中DMRB胞外电子传递能力的定性表征和定量检测。与传统方法相比，该方法具有快速灵敏、原位无损和操作简单等优点。此外，拟结合理论计算，从分子水平上进一步验证和解析DMRB胞外电子转移能力定性表征和定量测定的机理，并将此方法与微生物胞外电子传递呼吸链相关的分子生物学研究平台相结合，探索DMRB丰富的外膜蛋白在胞外电子传递中的作用，为环境中DMRB的基础研究和环境应用提供可靠的理论依据和实用的技术指导。

异化金属还原细菌(DMRB)在多种元素的地球化学循环、环境修复、废水处理和生物能产生等过程中都发挥重要作用。项目建立了定性表征和定量检测环境中DMRB胞外电子传递能力荧光探针的新方法，并在分子尺度上解析了荧光探测胞外电子传递过程的机制；在此基础上，从不同环境样品中筛选出了DMRB并比较其胞外电子转移能力，探索了环境中DMRB的分布规律及其环境功能。.研究发现核黄素能作为荧光探针定量检测DMRB的胞外电子转移能力，并成功地测定了模式两种DMRB Geobacter sulfurreducens DL-1 (60.29 fA)和Shewanella oneidensis MR-1 (2.11 fA)的胞外电子转移能力。与传统方法相比，该荧光探针方法简单、快速、可靠、灵敏度高；项目阐明了DMRB外膜蛋白与核黄素之间的电子传递机制，利用光谱电化学、电子顺磁共振、二维相关光谱等分析手段发现，氧化态Hemin(III)在电化学过程中仅能被还原为中间体Hemx(II)，但在核黄素存在的条件下，核黄素与Hemx(II)间的共轭效应促使氧化态Hemin(III)转变为完全还原态的Heme(II)；电子顺磁共振谱捕捉到了黄素类自由基中间产物与负离子中间产物的信号，实现DMRB外膜蛋白活性中心卟啉铁与核黄素间完整的电子传递机制的实时跟踪。理论模拟的结果与实验结果相吻合。.此外，项目利用新方法对人工环境和自然环境中的DMRB进行了高通量原位筛选，建立了一套简易、准确的细菌产电能力评价方法；通过对不同环境生物样品中DMRB物种组成及产电能力的综合分析，探明了环境中DMRB在污染湖泊、底泥、人工湿地及污水处理厂中的分布，考察了环境理化因子对群落中物种平均产电能力的影响。该方法有望成为选育、表征、研究DMRB的可靠手段。.通过项目的实施，成功地建立了几种定性表征和定量检测DMRB胞外电子传递能力的荧光探针检测新方法，定量测定了模式DMRB的胞外电子转移能力，确定了DMRB几种关键外膜蛋白在胞外电子传递中的作用和贡献率。结合理论计算方法进一步从分子水平上阐述DMRB胞外电子转移的的机理；将该方法应用到环境中DMRB的检测和筛选，并获取几株高产电能力菌株。该研究成果为环境中DMRB的基础研究和应用于污染物的还原降解提供了科学依据和技术支撑。

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