小菜蛾和兔子Ryanodine受体的分子克隆及比较药理学研究

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AI项目解读

基本信息

  • 批准号：
    31071716
  • 项目类别：
    面上项目
  • 资助金额：
    36.0万
  • 负责人：
    周小毛
  • 依托单位：
    湖南农业大学
  • 学科分类：
    C1405.植物化学保护
  • 结题年份：
    2013
  • 批准年份：
    2010
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2011-01-01 至2013-12-31

项目摘要

本研究拟在前期相关研究的基础上，利用已经建立的方法和技术，根据Ryanodine受体（RyR）基因的同源性，从分子生物学入手，分别克隆兔子和小菜蛾RyR基因，利用体外表达和生化毒理学分析，确定两者RyR的天然分子组成，结合生物信息学分析RyR蛋白的功能区域，比较两者的结构差异性。同时采用膜片钳技术测定不同抑制剂与受体不同结合位点的相互作用，研究两者的药理学差异，然后根据实验结果建立适合新型杀虫剂开发的分子模型。这不仅可以弄清RyR的分子组成，在理论上推动昆虫毒理学和生理学的发展，而且可以阐明杀虫剂的选择性机理，为生物合理设计高效高选择性的新型杀虫剂提供新靶标（新结合位点）、新思路和新途径。

结项摘要

采用RT-PCR结合race技术分别分段克隆出家兔骨骼肌中和小菜蛾体内RyR功能基因全长序列，通过比对分析发现小菜蛾RyR蛋白C端有一段总长约220Aa的插入,该插入肽段对小菜蛾RyR蛋白的二级空间结构具有重要影响，因此这段220个氨基酸的插入有可能对RyR的药理学特性产生影响。同时采用适时荧光定量PCR技术检测了RyR在小菜蛾不同发育时期的表达特征，结果表明RyR在幼虫时期表达量相对较低，而在蛹期和成虫发育阶段，该基因的表达量显著上升，特别是在蛹期表达量达到最高。通过比对氯虫苯甲酰胺抗性小菜蛾（抗性倍数为228）品系和敏感品系小菜蛾RyR蛋白C端氨基酸序列，发现抗性品系小菜蛾体内RyR氨基酸序列存在三个突变位点A4768V，F4856G，E4946D和一段氨基酸缺失序列△4946-4975。特别是由于氨基酸的缺失片段导致RyR蛋白跨膜结构的变化，有可能与小菜蛾对氯虫苯甲酰胺产生抗性有关。.通过构建表达载体，对家兔骨骼肌和小菜蛾体内RyR蛋白C端功能域进行表达并通过差示扫描量热法测定其与药剂氯虫苯甲酰胺亲和力大小。小菜蛾RyR蛋白C端及RyR蛋白C端与氯虫苯甲酰胺结合物的温度与DSC变化趋势是在低温下，随温度升高，DSC曲线下降，此时蛋白处于吸收热量的状态。当到达Tm值后，随着温度的上升，曲线升高，这是蛋白处于放热状态，表明蛋白的空间结构迅速被破坏以至于失活。小菜蛾RyR蛋白C端的Tm为 68.1℃，而小菜蛾RyR蛋白C端与氯虫苯甲酰胺结合后，Tm升至71.3℃。Tm升高了3.2℃。这表明氯虫苯甲酰胺可以增加片段的热稳定性，说明其与小菜蛾RyR蛋白C端产生了比较强的结合。家兔骨骼肌中RyR蛋白C端及RyR蛋白C端与氯虫苯甲酰胺结合物的温度与DSC曲线变化规律与小菜蛾一致。家兔跨膜蛋白C端的Tm值为72.06℃ ，RyR蛋白C端与氯虫苯甲酰胺结合物的Tm为71.90℃。相差仅0.16℃。这表明氯虫苯甲酰胺不能与家兔RyR蛋白C端结合或结合力很小。实验结果表明氯虫苯甲酰胺可以增加小菜蛾RyR 蛋白C端功能域的热稳定性，但不能增加家兔RyR 蛋白C端功能域的热稳定性。证明了氯虫苯甲酰胺可以与小菜蛾RyR蛋白C端功能域相结合，但不能与家兔RyR蛋白C端功能域相结合或者结合力很小，这可能正是氯虫苯甲酰胺对哺乳动物和昆虫之间的选择性毒性的分子机制。

项目成果

期刊论文数量（4）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（2）
小菜蛾海藻糖酶酶学特性及四种杀虫剂对其活性的抑制作用
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    2012
  • 期刊：
    应用昆虫学报
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    马俊;周小毛;王翰
  • 通讯作者：
    王翰
6种杀虫剂对小菜蛾的室内毒力及田间防效
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    2013
  • 期刊：
    安徽农业科学
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    林钰婷;周小毛
  • 通讯作者：
    周小毛
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  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    2013
  • 期刊：
    植物保护
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    刘佳;李如美;周小毛
  • 通讯作者：
    周小毛
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  • DOI：
    10.1007/s10340-013-0505-y
  • 发表时间：
    2013
  • 期刊：
    Journal of Pest Science
  • 影响因子：
    4.8
  • 作者：
    Tong, Hong;Su, Qi;Zhou, Xiaomao;Bai, Lianyang
  • 通讯作者：
    Bai, Lianyang

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  • 通讯作者：
    周小毛
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  • DOI：
    --
  • 发表时间：
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  • 期刊：
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  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    朱航;王雅菲;周小毛
  • 通讯作者：
    周小毛

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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

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          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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